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【交流】CFSE标记T细胞检测扩增

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最近尝试使用CFSE检测人外周血CD4+T细胞体外扩增情况,操作流程如下:

1、分离CD4+T:Ficoll分离人外周血PBMC,CD14磁珠(Miltenyi)阴选其中CD14-细胞,CD4磁珠(Miltenyi)阳选CD4+T细胞,流式检测CD4+T纯度>98%(两步法按照Miltenyi CD4磁珠protocol);

2、CFSE标记:CFSE试剂购自Invitrogen(C34554)。标记步骤按照试剂protocol,即:定容至1x106个细胞/ml→直接向细胞悬液中加入5mM CFSE储存液,终浓度为0.5uM~4uM→37℃孵育染料10min→使用5倍体积冰上预冷培养基淬灭染料→冰上孵育5min→洗3遍→铺板(96孔板,每孔1x105);

3、刺激:使用DMEM+10%FCS作为全培,各组分别给予可溶性anti-CD3/28、Miltenyi T细胞活化磁珠(负载anti-CD2/3/28抗体,磁珠/细胞ratio为1:2)、活化磁珠+rh IL-2(100IU/ml)。体外培养3~4天后检测。

但出现的问题是尽管镜下可观察到CFSE标记T细胞聚集成团,但流式(BDCaliber)示细胞体积不增大,且大部分细胞死亡,提示细胞状态很差。已经重复两次,均是如此。实验室此前使用CFSE检测过人PBMC中T细胞增殖,自己也使用肿瘤细胞系进行过预实验,均无问题。

附:

现考虑原因如下:

1、CFSE protocol建议使用含0.1%BSA的PBS作为buffer,但此前均使用含0.1%FBS的PBS。但BSA与FBS的影响有这么大么?

2、直接向细胞悬液中加入CFSE储存液,不知是否应先配成2x工作液,再与细胞悬液混合。
3、根据流式前向/侧向角,似乎CFSE浓度越高,细胞状态越差,CFSE是否对T细胞本身具有毒性?

4、摸索的CFSE标记浓度包括0.5/1/2/4uM,现在看似乎0.5uM下细胞状态最好(但仍然较差),且可看到增殖峰,CFSE浓度较高时扩增反而不明显,在此想请教,如果不同浓度CFSE均能标记上T细胞,是浓度较低好还是较高时为佳?此前使用PBMC摸条件时示CFSE在2或4uM时结果最为理想。

在此希望请教有经验的前辈,分析下实验不成功的原因,并分享下自己的成功经验,十分感谢!

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