【交流】CFSE标记T细胞检测扩增

最近尝试使用CFSE检测人外周血CD4+T细胞体外扩增情况，操作流程如下：

1、分离CD4+T：Ficoll分离人外周血PBMC，CD14磁珠（Miltenyi）阴选其中CD14-细胞，CD4磁珠（Miltenyi）阳选CD4+T细胞，流式检测CD4+T纯度>98%（两步法按照Miltenyi CD4磁珠protocol）；

2、CFSE标记：CFSE试剂购自Invitrogen（C34554）。标记步骤按照试剂protocol，即：定容至1x106个细胞/ml→直接向细胞悬液中加入5mM CFSE储存液，终浓度为0.5uM~4uM→37℃孵育染料10min→使用5倍体积冰上预冷培养基淬灭染料→冰上孵育5min→洗3遍→铺板（96孔板，每孔1x105）；

3、刺激：使用DMEM+10%FCS作为全培，各组分别给予可溶性anti-CD3/28、Miltenyi T细胞活化磁珠（负载anti-CD2/3/28抗体，磁珠/细胞ratio为1:2）、活化磁珠+rh IL-2（100IU/ml）。体外培养3~4天后检测。

但出现的问题是尽管镜下可观察到CFSE标记T细胞聚集成团，但流式（BDCaliber）示细胞体积不增大，且大部分细胞死亡，提示细胞状态很差。已经重复两次，均是如此。实验室此前使用CFSE检测过人PBMC中T细胞增殖，自己也使用肿瘤细胞系进行过预实验，均无问题。

附：

现考虑原因如下：

1、CFSE protocol建议使用含0.1%BSA的PBS作为buffer，但此前均使用含0.1%FBS的PBS。但BSA与FBS的影响有这么大么？

2、直接向细胞悬液中加入CFSE储存液，不知是否应先配成2x工作液，再与细胞悬液混合。
3、根据流式前向/侧向角，似乎CFSE浓度越高，细胞状态越差，CFSE是否对T细胞本身具有毒性？

4、摸索的CFSE标记浓度包括0.5/1/2/4uM，现在看似乎0.5uM下细胞状态最好（但仍然较差），且可看到增殖峰，CFSE浓度较高时扩增反而不明显，在此想请教，如果不同浓度CFSE均能标记上T细胞，是浓度较低好还是较高时为佳？此前使用PBMC摸条件时示CFSE在2或4uM时结果最为理想。

在此希望请教有经验的前辈，分析下实验不成功的原因，并分享下自己的成功经验，十分感谢！