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CFSE检测人外周血T细胞体外扩增

相关实验:CFSE检测人外周血T细胞体外扩增

最新修订时间:

简介

CFSE 检测人外周血 T 细胞体外扩增的是指利用 CFSE 对活细胞进行荧光标记,从而用于检测细胞增殖,细胞周期的估算及细胞分裂等方面,这里仅介绍 CFSE 检测人外周血 CD4+ T,CD8+ T 和γδ+ T 细胞体外扩增技术。

原理

CFSE 检测人外周血 T 细胞体外扩增的基本原理是利用 CFSE 可结合细胞内蛋白质的特性,对活细胞进行荧光标记。在细胞分裂增殖过程中, CFSE 的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减,标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半,根据这一特性,它可被用于检测细胞增殖,细胞周期的估算及细胞分裂等方面。

材料与仪器

器材:

流式细胞仪

试剂:

① 活细胞染料 CFSE
② PBS
③ 含 10% 小牛血清的 1640 培养基

④ PHA 10 μg/ml,抗体 CD 35 μg/ml,结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb - Ag)5 μg/ml

⑤ IL-2 (50 U/ml)
⑥ 一抗以及荧光素标记的二抗、同型对照抗体

耗材:

流式专用样品管、离心机、玻璃管、24 孔板

步骤

CFSE 检测人外周血 T 细胞体外扩增的基本过程可分为如下几步:

1. 人外周血单个核细胞(PBMC)的分离。

2. 准备细胞悬液,用 PBS 等合适的培养基调整细胞浓度至约 1 x l07 ml-1

3. 取 1 ml 细胞悬液至试管中,加入适量 CFSE 工作液,轻轻搅拌混匀。

4. 在 37 ℃ 培养箱中培养 15~30 min。

5. 离心后去上清,加入 2 ml 10% 小牛血清的 1640 溶液,再离心后去上清,重复此操作 1 次。

6. 加入合适的培养基制成细胞悬液。

7. 铺板(24 孔板,每孔 1 x 106)。

8. 刺激。分别加 PHA 10 μg/ml(PHA 刺激组),或抗体 CD 35 μg/ml(CD3 刺激组)或结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)5 μg/ml(Mtb-Ag 刺激组),37 ℃ 培养箱中培养,每隔 3 d 加 IL-2(50 U/ml)以扩增细胞。

9. 收集用 PHA 或 CD3 mAb 刺激培养 3d 和 5d 的细胞,Mtb-Ag 刺激组于 8d 后收集细胞,用抗 CD4-PE、抗 CD8-PE、抗 TCR78-PE 作细胞表面分子染色。然后在流式细胞仪上检测,以 CFSE 第一荧光 (FL-1),PE 标记抗体为第二荧光 (FL-2), 用 Cell Quest 软件获取数据,然后分析不同 T 细胞亚群的增殖动力模型。

注意事项

1. 溶解 CFSE 的 DMSO 需要保证新鲜无水,否则会导致 CFSE 的 AM 体提前水解, 发出绿色荧光,影响实验效果。

2. CFSE 工作液应现配现用,因为 CFSE 吸水会分解,影响染色效果。

常见问题

为确定最佳染色浓度,建议 CFSE 的终浓度参考相关论文或做 个预实验,分别设定终浓度为 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0 μM……然后上机检测染色效果,确定所有细胞都能染上 CFSE, 如果浓度过高可能会导致增殖后分群不太明显。

来源:丁香实验

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