简介
CFSE 检测人外周血 T 细胞体外扩增的是指利用 CFSE 对活细胞进行荧光标记，从而用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面，这里仅介绍 CFSE 检测人外周血 CD4+ T，CD8+ T 和γδ+ T 细胞体外扩增技术。
原理
CFSE 检测人外周血 T 细胞体外扩增的基本原理是利用 CFSE 可结合细胞内蛋白质的特性，对活细胞进行荧光标记。在细胞分裂增殖过程中， CFSE 的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。
材料与仪器
器材：
流式细胞仪
试剂：
① 活细胞染料 CFSE
② PBS
③ 含 10% 小牛血清的 1640 培养基
④ PHA 10 μg/ml，抗体 CD 35 μg/ml，结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb - Ag）5 μg/ml
⑤ IL-2 (50 U/ml)
⑥ 一抗以及荧光素标记的二抗、同型对照抗体
耗材：
流式专用样品管、离心机、玻璃管、24 孔板
步骤
CFSE 检测人外周血 T 细胞体外扩增的基本过程可分为如下几步：
1. 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离。
2. 准备细胞悬液，用 PBS 等合适的培养基调整细胞浓度至约 1 x l07 ml-1。
3. 取 1 ml 细胞悬液至试管中，加入适量 CFSE 工作液，轻轻搅拌混匀。
4. 在 37 ℃ 培养箱中培养 15～30 min。
5. 离心后去上清，加入 2 ml 10% 小牛血清的 1640 溶液，再离心后去上清，重复此操作 1 次。
6. 加入合适的培养基制成细胞悬液。
7. 铺板（24 孔板，每孔 1 x 106）。
8. 刺激。分别加 PHA 10 μg/ml（PHA 刺激组），或抗体 CD 35 μg/ml（CD3 刺激组）或结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）5 μg/ml（Mtb-Ag 刺激组），37 ℃ 培养箱中培养，每隔 3 d 加 IL-2(50 U/ml）以扩增细胞。
9. 收集用 PHA 或 CD3 mAb 刺激培养 3d 和 5d 的细胞，Mtb-Ag 刺激组于 8d 后收集细胞，用抗 CD4-PE、抗 CD8-PE、抗 TCR78-PE 作细胞表面分子染色。然后在流式细胞仪上检测，以 CFSE 第一荧光 (FL-1）,PE 标记抗体为第二荧光 (FL-2）, 用 Cell Quest 软件获取数据，然后分析不同 T 细胞亚群的增殖动力模型。
注意事项
1. 溶解 CFSE 的 DMSO 需要保证新鲜无水，否则会导致 CFSE 的 AM 体提前水解, 发出绿色荧光，影响实验效果。
2. CFSE 工作液应现配现用，因为 CFSE 吸水会分解，影响染色效果。
常见问题
为确定最佳染色浓度，建议 CFSE 的终浓度参考相关论文或做 个预实验，分别设定终浓度为 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0 μM……然后上机检测染色效果，确定所有细胞都能染上 CFSE, 如果浓度过高可能会导致增殖后分群不太明显。
来源：丁香实验
