免疫组化难题集锦

1、在什么情况下使用TritonX-100？

（1）Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(>10um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

（3)Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用，详细见下图

2、封闭血清的选择原则是什么？

（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！

（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

3、抗体孵育条件的比较？

（1）一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

（2）二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。

4、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温？

（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

（3）其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！