免疫组化难题集锦
丁香园
1、DAB显色时间如何把握?
(1)DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现浅棕色本底时即可冲洗;
(2)DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;
(3)此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;
(4)DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。
2、免疫组化结果如何分析?
(1)阳性着色细胞计数法。在4undefined光镜下,随机选择不重叠的10个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组3~6张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可。
(2)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析,然后进行统计分析即可。
(3)评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%),最终可以分数相加,再进行比较。
注:对2中的这几种方法,各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
3、在什么情况下进行组织抗原修复,抗原修复的条件是什么?
(1)由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性。通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。
(2)修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料,大量的:中性的、高pH的等)。
(3)微波修复,我们一般用6miundefined4次,效果不错。