山茶属植物叶片DNA抽提

摘　要　对植物中DNA抽提是在分子水平上对植物进行系统分析与研究的基础性工作.经多次实验，使用改良的CTAB法抽提山茶属植物中总DNA，即在抽提前加入抗氧化剂β-巯基乙醇，并使用冷冻的异丙醇来沉淀DNA， 获得了较好的效果，其纯度和得率完全能满足常规分子生物学操作的要求.

关键词　山茶属植物；DNA抽提；叶片；改良CTAB法

中图法分类号　Q523；Q949.758.4

DNA Extraction From the Leaves of Camellia Plants

Tan Xiaofeng Qi LonglinHuang XiaoguangGui Jun

(National Forestry Bureau Key Laboratory of Non-timber Product Frostry Breeding and Cultivation,

Central South Forestry University, Zhuzhou, Hunan,412006)

ABSTRACT　DNA extraction of plant is a basic work to systematically analyse and study plant at molecular level. An improved

CTAB method was found to extract DNA from leaves of Camellia plants.It is adding β-mercaptoethanol anti-oxidant before DNA extraction and using isopentenol to precipitate DNA. The purity of DNA extracted is between

1.4 and 1.8,which is suitable for RAPD experiment.

KEY WORDS　Camellia plant,DNA extraction，leaf blade，improved CTAB method

生物基因组DNA主要包括线粒体DNA（mt DNA）、核DNA（n DNA）和叶绿体DNA（cpDNA）.从生物组织中抽提DNA是对生物体进行遗传和分子生物学分析与操作的最基本的步骤和环节.动物与微生物的细胞无细胞壁，组成相对较为简单，其DNA抽提也较简单；

植物组织DNA的抽提步骤则要繁杂得多，而且由于不同植物间的化学成分差异，其中主要是酚类等对DNA抽提的影响很大，因而具体到不同的植物，其抽提方法又略有不同.山茶属植物种类很多，其中不同的类群之间组成成分差异也较大.本研究的目的是探索山茶属植物通用的DNA抽提方法，为进一步开展山茶属植物在DNA水平上的系统分析、研究奠定基础.

1　材料和方法

1.1　实验材料

实验的金花茶组植物叶片采自广西南宁金花茶公园，置于-76℃超低温冰箱中保存备用.其它山茶属植物叶片材料采自中南林学院山茶属植物基因库.用于DNA抽提实验的山茶属植物共32种（见表1）.这些种类代表了山茶属植物2个亚属当中的大部分组.

表1　山茶属植物DNA抽提实验材料

Table 1　Experimental materials from Camellia plants

1.2　DNA抽提试剂

(1)1.5% CTAB液(CTAB粉末15 g/L, Tris-HCl 0.075 mol/L ,NaCl 61.4 g/L )；(2)10%的CTAB液 (CTAB粉末 100 g/L ,NaCl 40.95 g/L )；(3) β-巯基乙醇（体积分数>99%）；(4）氯仿/异戊醇液（体积比 24∶1）；(5)NaCl 溶液（1 mol/L）；(6)RNaseA；(7)TE液；(8)体积分数大于99.5%和等于76%乙醇.

1.3　实验方法

首先采用标准的水稻DNA抽提方法（CTAB法），但效果不理想.后通过查阅相关资料，我们采用改良的CTAB法，具体方法如下：

（1）每份材料取叶7 g，加液氮后，用乳钵磨碎，于-20℃冰箱中冷冻10～15 h.

（2）分别加入β-巯基乙醇210 μL，搅拌均匀.

（3）加入1.5%的CTAB液20 mL，搅匀，在56℃条件下水浴20 min.

（4）转入50 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇液，轻轻摇匀.

（5）室温下以4 000 r/min速度离心20 min.

（6）取上清液转入另一50 mL的离心管中，加入10%CTAB液，加入量为上清液体积的1/10，摇匀，再加入20 mL氯仿-异戊醇液，轻轻摇匀.

（7）室温下以4000 r/min速度离心20 min.

（8）重复步骤（6），（7）1～2次.

（9）取上清液转入另一50 mL的离心管中，加入冻冷（-24℃）异丙醇，加入量为上清液体积的2/3，轻轻摇晃至絮状物出现.

（10）以2 000 r/min速度离心20 min.

（11）倾去离心液，倒置离心管干燥DNA.

（12）每管加入浓度为1 mol/L的NaCl溶液5 mL和RNaseA 5 μL,在56℃条件下水浴12 h以上.

（13）加入体积分数为99.5%的冷乙醇，加入量为上清液体积的2倍，沉淀DNA.

（14）用取液器吸出DNA，置于体积分数为76%的乙醇中洗30 min.

（15）转入体积分数大于99.5%的乙醇中10 min.

（16）干燥后溶解在1.5 mL的TE液中，于冰箱中4℃保存.

2　结果与分析

动物、微生物总DNA抽提通常采用酚-氯仿抽提；从植物种子中抽提DNA，因种子所含杂质少，多采用SDS法.目前能有效去除植物多糖、酚类化合物和其它杂质的总DNA抽提方法主要有两种：一种是CsCl梯度离心法，另一种是CTAB法.前者由于仪器设备比较贵重，使用受到限制，后者不需要贵重仪器，操作较为简单，能适用于许多植物的DNA抽提，纯度也能满足分子生物学实验操作的要求，因而从植物叶片组织中抽提DNA多采用此法.我们使用标准的CTAB法抽提山茶属植物叶片DNA，在抽提过程中抽提液明显变黄，在用乙醇沉淀时则伴有大量的粘性物质析出，这可能与山茶属植物叶片含较多酚类等物质有关.据报道，在提取银杏Ginkgo bliba^［1］、银杉Cathaya argyrophylla^［2］和陆均松Dacydium pierrei^［3］的DNA时遇到同样的情况，并认为对于有些种，特别是裸子植物，CTAB法是失败的.最后我们采用改良的CTAB法，在抽提前加入抗氧化剂β-巯基乙醇，用异丙醇沉淀DNA，并且增加了一次氯仿/异戊醇液抽提，使山茶属植物叶片DNA抽提获得成功，32个物种DNA纯度均在1.4～1.8之间，并且DNA得率较高，每克叶片最高可获得110 μg DNA，平均每克叶片可获DNA 25 μg^［4］.

实验证明，这种改良的CTAB抽提法适用于山茶属植物叶片DNA抽提，提取的DNA量大，质量也较好，能满足RAPD和其它分子生物学分析的要求.

为了提高DNA的纯度和得率，建议选用较幼嫩的叶片，因为处于延伸生长期的植物细胞果胶含量较少.在抽提过程中，发现不同种其抽提效果及DNA得率也有较大的差异，东兴金花茶DNA得率最高可达110 μg/g，而红皮糙果茶的得率却只有12 μg/g，这可能是由于不同种其叶片中酚类和脂类等杂质含量差别较大，从而影响到DNA抽提过程中DNA的得率.

3.2　实验中应注意的问题

对于DNA的纯化要达到以下3点要求：（1）DNA样品中不应存在有对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；采用改良的CTAB法，利用氯仿、异戊醇可去除有机溶剂，而EDTA可以螯合二价金属离子；（2）应将其它生物大分子，如蛋白质、多糖、脂类分子降低到最低程度，我们通过延长离心时间，增加氯仿-异戊醇的抽提次数，可使杂质量降到最低；（3）排除其它核酸分子的污染，可通过加入RNaseA，将混在DNA中的RNA降解掉.

为了保证分离核酸分子的完整性和纯度，在实验过程中还应注意：（1）尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；（2）减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作须在pH值为4～10的条件下进行；（3）减少物理因素对DNA的降解，将DNA溶于TE液中于4℃保存，TE液中的EDTA可螯合二价金属离子以抑制DNA酶的活性，TE的pH值为8，可减少DNA的脱氨反应，在这种条件下DNA可保存5 a以上^［5］.

作者简介：谭晓风，男，博士，教授。

作者单位：中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南株洲市，412006

参　考　文　献

1　谭晓风. 银杏RAPD遗传图谱的构建及主要栽培品种和雌雄株的分子鉴别：［学位论文］. 株洲：中南林学院，1997

2　邹喻平，汪小全，雷一丁，等. 几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定.植物学报，1994，36：528～533

3　苏应娟，王艇. 陆均松不同居群的RAPD分析.中山大学学报，1999，38（1）：98～101

4　罗春清，谭晓风，漆龙霖.山茶属植物分类综述.中南林学院学报，1999，19(3)：78～81

5　J 萨姆布鲁克，E F 弗里奇，T曼尼阿蒂斯. 分子克隆操作指南.第二版.北京： 科学出版社，1992