酶联免疫吸附试验（ELISA）测定伤寒杆菌“O”抗体

酶联免疫吸附试验是用酶标记的抗体（或SPA）检测未知抗原或抗体的方法。此法敏感性高，特异性强。常用的是ELISA方法，间接法，双抗体法和抗原法。本次试验介绍，酶联葡萄球菌蛋白A免疫分析法。

1、加抗原使之吸附于固相载体（如塑料反应板）

2、洗涤加待测血清

3、洗涤加酶标记SpA

4、洗涤加酶的底物。经酶的催化产生有色产物。

一、材料：

1、聚乙烯塑料反应板（PH9.6时可吸附蛋白Ag）

2、抗原：伤寒杆菌O901煮沸或超声波粉碎抗原

3、待测血清

4、冻干酶联葡萄球菌A蛋白（HRD-proteinA）纯品

5、邻苯二胺（OPD）

6、包被液：0.05M碳酸钠-碳酸氢钠溶液PH9.6

7、稀释液：10%免疫血清PBS-吐温20，防止非特异性吸附

8、洗涤液：0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特异性吸附

9、底物溶液：0.02M磷酸氢二钠25.7毫升

0.1M柠檬酸24.3毫升

蒸馏水50毫升

临用前新鲜配制，在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺，然后加入30%双氧水0.15毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。

10、终止液；2M硫酸

二、方法：

1、抗原包被

取洁净的聚苯乙烯微量反应板，于每孔内加伤寒抗原0.1毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白含量10微克/毫升），置37℃1小时，弃抗原液，用洗涤液3次每次3分钟。

2、加待测血清

于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。置37℃30分钟，洗涤3次。

3、加酶联A蛋白

于每孔加酶联A蛋白各0.1毫升，置37℃20分钟，洗涤3次。

4、加临时配制的底物溶液各0.1毫升，置暗处15分钟。加2M碳酸1滴终止反应。

5、结果判断：（肉眼判断）

若颜色于阴性对照相同则为阴性，若较阴性对照深则为阳性，根据颜色深浅以（+）表示。