ELISA测定疫苗的抗体实验设计

1、Q: 要测定打疫苗三次的抗体的变化，当ELISA标化后，是不是要用同一个抗原的包被浓度，同一个血清的稀释度，然后看OD值的变化？实验动物有多个，实验数据又如何处理呢？

A: nanwxd网友观点：

关于是不是要用同一个抗原的包被浓度，同一个血清的稀释度，然后看OD值的变化？

这是肯定的ELISA做得很好的话批间CV都要有10～15％左右，最好用同一个抗原，但对于包被的抗原浓度对OD的影响不是很大，只要不是差别太大即可。抗血清当然要用同一个稀释度了。另外比较的话就必每批，每块板上的样品都要伴随着一个参比品一同做，参比品（自己可以选定一个，如第一次免疫获得的抗血清凭取一个。当然免疫是有一个间期的，参比品的保存是一个问题，本试验中用的参比品为抗血清，我想以加入30％甘油-20度冻藏比较稳妥）最好还是同一个这样才能保证实验结果的可比性。

分析：

（1）将同 一只动物免疫不同时间后抗体产生的效价进行比较。

（2）由上面可以得出一组数据，举个例子即如某个免疫间期抗体升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多数情况下可升高多少，即此种升高率的阳性率，然后再用泊松分布证明此阳性率是否附和总体在这个免疫间期增高的阳性率，还是由于随机误差的原因使实验得到了这个结果。

（3）统计出不同间期的效价水平后，可以用方差分析进行总体比较，证明不同间期免疫的效果差异是否有统计学意义；然后再两两之间进行比较看看免疫效果最明显的是哪个间期。

2、Q：血清做个什么样的稀释才能保证这个时候由血清的本底反应造成的假阴性或者假阳性少呢？用一份血清做琼扩，效价在1：8，没有达到很好的结果，但是这份血清用ELISA测OD值是或许能够达到一个很大值，这个问题怎么解决？

A: nanwxd网友观点：

（1）血清做个什么样的稀释才能保证这个时候由血清的本底反应造成的假阴性或者假阳性少呢？

本底反应一般是造成假阳性，对于假阴性hanyongjun_4675战友的意思是说实验中出现了ELISA做出来的是阴性，但琼脂糖免疫扩散是阳性？是否由于假阴性的存在是有干扰的类似物存在？

（2）ELISA测得的OD值很高，但琼扩，效价不高，只有1：8

这个问题对于不同个动物之间也许会存在，但对于同一个动物身上出现的可能性比较少，出现这种情况原因多为抗体亲和力的问题，还有非特异性干扰的因素，对于后者可以做阴性对照进行消除，阴性对照可以有两种方法：a.用没有免疫的与被免疫动物同种的动物的血清做对照。b.对于用了佐剂的，最严谨的实验设计是应该用几只动物只免疫不加抗原的佐剂，因为佐剂本身也会产生一定的抗体，这种抗体是否会与你免疫的抗原之间产生交叉反应，这也是值得考虑的问题。

此外还需要注意的一个问题是，免疫早期产生的是IgM，后斯产生的是IgG，那么这就存在这两种抗体水平的比较。同时也就要注意酶标抗抗体的特异性的问题，即有的抗抗体只针对IgG，而有的特异性则不太好。