酶联免疫吸附试验（ ELISA ）

免疫酶联吸收试验（ ELISA ）于 1971 年分别由瑞典学者 Engrall 和 Perlmann 、荷兰学者 Van Weeman 和 Schuurs 报道。其基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；测定时，将受检样品（含待侧抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量（免疫复合物）即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例；经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中抗原或抗体含量。间接免疫酶联吸收是测定抗体最常用的方法，其原理是将抗原联接到固相载体上，样品中待检抗体与之结合成固相抗原 - 受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原 - 受检抗体 - 酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，对待检抗体进行定性或定量测定（图 7-1 ）。

【材料】

1. 抗原：艾特利根瘤菌（ Rhizobium etli ）菌悬液（见实验三）；

一抗：兔抗艾特利血清（见实验三），二抗： 辣根过氧化物酶（ Horseradish Peroxidanse ， HRP ）标记羊抗兔 免疫球蛋白 （ IgG ）（购自中国军事医学科学院）。

2. 0.015M 、 pH 7.4 PBS ， 邻苯二胺（ OPD ）泡腾片溶液， 2mol/LH2SO4 。

3. 酶标板。

【方法】

1. 包被：将菌悬液放入 96 孔聚乙烯酶标板孔内，并加入生理盐水 100 m l ，酶标板置湿盒中 4 ℃ 过夜，第二天取出，用 PBS （配方见附录）洗涤 3-4 次后用 封口膜 封存， 4 ℃ 冰箱保存备用。设置阴性对照孔，孔内只加生理盐水。

2.与一抗反应：在样品孔和对照孔内加 1 ： 4000 一抗 100 m l ，置湿盒 37 ℃ 保温 1h ，倾去液体，用 PBS 洗涤 3-4 次。

3.与二抗反应：在样品孔和对照孔内加 1 ： 4000 羊抗兔 IgG 100 m l ，置湿盒 37 ℃ 保温 3h ，倾去液体，用 PBS 洗涤 3-4 次。

4.显色反应：在样品孔和对照孔内加 H 2 O 2 溶解的 邻苯二胺（ OPD ）泡腾片溶液 100 m l ，在暗处避光显色 20min ，加入 2mol/LH 2 SO 4 终止反应。

【结果判定】

阴性对照孔为淡黄色，加入一抗的孔呈橙色，为阳性反应（图 7-2 ）。

【注意事项】

• 报被时间不少于 18 小时。

• 报被和温育应将固相载体放在湿盒内进行。

• 洗板一定力求干净，以保证实验成功。

图 9-1 免疫酶联吸附实验（ ELISA ）的实验原理

图 9-2 定性 ELISA 实验结果，左为阳性结果，右为阴性结果。