实验达人推荐的磷酸化蛋白的Western操作指南
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在 western blot ting 方面，本文绝对是一个新手，目前正准备磷酸化蛋白的 Western，急需这方面的实验技术操作步骤和一些注意事项的指导。在网络上搜集整理了一个 western blot 实验达人的建议，供大家参考。
我做了很久的 western blot，尤其是 phospho-抗体，可以算是达人了。我根据自己的经验，对磷酸化蛋白之 western blot 提出以下建议，供刚入门的同仁参考：
1. 一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使 band 压出来也会很浅，结果也不可信。
2. 加一抗后最好 4 度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4 度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温 1 小时即可。
3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling 公司做的磷酸化抗体不错，尤其是 MAPKs 磷酸化抗体。
3. 最好根据厂商的 protocol 来操作实验，这是实验成功的保证。如 Cell signaling 会建议用含 5%BSA 的 TBST 稀释 phospho-p38 等抗体，效果不错，而不是用常见的含 5%non-fat milk 的 TBST。
4. 抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。
5. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完 phospho-p38 抗体后，我会把相同的 membrane 做 strip 后再压 p38, 然后再 strip 一次，再压内标 actin。
6. 做磷酸化蛋白 WB 时, 除了目标蛋白的 band 以外, 往往会出现非特异性的 band. 磷酸化抗体不好的话, 甚至会压出非特异性的 band, 而没有你想要的 band, 所以压片以后, 你一定要根据 markers 比对一下, 你压出的 band 分子量是否正确. 我以前压 WB 时, 压出了一条 band, 就以为是我想要的那条, 然后还根据趋势推测可能的机制, 走了不少怨枉路. 还有一次, 把 markers 的分子量记错了, 比对出来的结果当然也不对.
7. 磷酸化蛋白 WB 时 backgroud 也往往较深, 所以压片时间要适当, 不能太长或过短, 太长则 backgroud 太深盖住想要的那条 band, 时间过短则可能没有 band 或者 band 太浅.
8. 磷酸化蛋白 WB 时, 用 TBST 洗时也要注意一下, 摇床的转速不要太快, 洗的时间不要太长, 孵育一抗和二抗之后分别洗 5 min 3 次即可, 宁愿 background 深一些, 总比做不出来强得多. 另外，洗的时候，最好不要把几张 membrane 叠在一起洗。
9. 下图列出的是我所用的做磷酸化蛋白 western blot 的 lysis buffer 的配方, 效果不错, 供您参考。
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10. 对我的 lysis buffer 配方作以下说明:
(1)Na3VO4 要活化
(2) 我的配方配的是 100 ml 细胞裂解液, 但如您各个成分的体积加起来, 会发现 total=102.1 ml, 那是因为这些成分加在一起后总体积会缩小的.
11. 正如我在第 5 点所说的,"研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量「。这有两种方法，一是：相同的 sample 在不同的 well 中上样两次 (可在相同的 gel 上，也可在不同的 gel)，其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量 (包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白)，甚至还可跑另一个 gel，压内标。
但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去 (strip)，strip solution 如下:
100 mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取 697.6ul)
2% SDS (stock 10%, 取 20 ml)
62.5 mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取 6.25 ml)
加水至 100 ml
然后 50 度水浴 30 min.
许多人会建议 55 度水浴 30 min。Strip solution 是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为 55 度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为 50 度 30 min，既能有效去除已结合的抗体，又比 55 度更能保护蛋白.
12. Strip 时一定要注意：membrane 一定要完全泡在 strip solution 中 (可用较硬的塑料膜封好)，然后要完全浸入水中，使受热均匀。
这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。我曾将同一张 membrane 用我提供的方法 strip 了 3 次，分别压不同的抗体 (因为有时候蛋白分子量很接近)，效果都不错。
13. Activation of Sodium OrthoVanadate
(1). Make Sodium orthovanadate to 200 mM in ddH2O.
(2). Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pH varies depending on the lot of the chemical). At pH 10.0 the solution is yellow.
(3). Boil the solution until it turns colorless (about 10 mins).
(4). Allow solution to cool to room temperature.
(5). Readjust pH to 10.0 and repeat steps 3 & 4 until the soluition remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store in aliquots at -20 oC.
NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, converting it to a more potent
inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J. Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.
