吖啶橙原值区分组织细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法

1．溶液制备

(1)0．1％吖啶橙浓缩液(避光，4℃保存)

吖啶橙 0．1g

双蒸水 100ml

(2)0．067mol／L磷酸盐缓冲液(pH 6．0)

双蒸水 90ml

磷酸氢二钠(Na2 HP04 ・12H2 0) 0．34g

磷酸二氢钾(KH2P04) 0．78g

NaCl 0．89g

完全溶解后加双蒸水至100ml；

(3)固定液：选用Carnoy或乙醇固定液；

(4)吖啶橙工作液：用前配制，吖啶橙浓缩液与PBS比为l：9；

(5)0．1mol／L氯化钙；

(6)1％醋酸。

2．操作程序

(1)石蜡切片按常规脱蜡处理．冰冻切片直接进行步骤(2)；

(2)1％醋酸液中轻轻洗6―30秒；

(3)蒸馏水洗2次，每次2～3分钟；

(4)PBS漂洗2分钟：

(5)吖啶橙工作液染色3一15分钟；

(6)PBS漂洗2次．每次3～5分钟；

(7)0．1mol／L氯化钙液中分化30秒，若切片厚，分化时间可延长至核界限清晰为止

(8)用PBS彻底漂洗，除去氯化钙；

(9)水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察分析。

结果：细胞核或DNA病毒包涵体呈绿色荧光．而核仁和细胞质内RNA或RNA病毒包涵体呈橘红色荧光。另外，可见组织中肥大细胞的颗粒和软骨基质中的酸性粘多糖以及嗜碱性和嗜酸性颗粒等发红色荧光．中性颗粒呈橘红色荧光，血管弹性纤维发黄色荧光。角蛋白呈绿色荧光，观察时应注意区别。

3．注意事项

吖啶橙染色法

(2)该方法可用于恶性肿瘤如宫颈癌脱落细胞普查等。非典型增生细胞呈现荧光增强，增生的细胞胞质呈强荧光。恶性肿瘤细胞呈火焰或橘红色荧光。

(3)在荧光显微镜下区分活细胞和死细胞时。可直接将少量细胞悬液与0．01％吖啶橙工作液混合，镜下观察。活细胞的核呈黄绿色荧光。而死细胞呈红色荧光，后者系溶酶体酶释放所致。吖啶橙浓度过高如l：500，或过低如1：100000时，均影响结果的准确性和可信性。