【DNA Bisulfite处理以及甲基化特异PCR】

求助坛内有经验者：

在DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的准备工作时候，遇到了一些困难。

先不提DNA Bisulfite 处理以及甲基化特异PCR的意义了。

1.应该说甲基化特异PCR是1996年开始的，原始论文：Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands (见下贴附件)。
其中关于DNA的Bisulfite处理见本贴附件。

2.而在《Current protocols of Human Genetics》里面也有《Methylation-specific PCR》这一章（见下贴附件）。现在大部分文章还是引用这两个的。

3.我也search了dxy里的帖子，几乎都看了，肿瘤所的战友帖子如下：

肿瘤所DNA处理（亚硫酸氢钠）

第一天

1． 稀释2ugDNA（用双蒸水）至10ul（1.5ml离心管）

2． 加1.1ul 3M的NaOH,混匀

1.5g NaOH+12.5ml H2O----3M NaOH

3． 37度温浴10min(水浴)

4． 6 ul 10Mm的氢鲲(hydroquinone)----色转黄

氢鲲的配置(需现配):

55mg氢鲲+50ml H2O-----10Mm的氢鲲

5 轻轻摇匀

6 加104ul的亚硫酸氢钠(Bisulfite)(3.6M)( Ph5.0 ,用NaOH调Ph)

亚硫酸氢钠(需现配): 可用8份

2.88g亚硫酸氢钠+5mlH2O

0.85ml 3M NaOH稀释上述5ml液体至pH 5.0

7 加200ul 矿物油至管顶端, 50度温浴18小时(过夜)

第二天

8 1%琼脂糖，每管加1ml，样品数2，放200ulTip头，凝固。

9 把样品吸出，至孔中，1小时后转移至另一孔，再放置1小时。

10 离心,洗脱(最大转速为13000转/分)

11 加11ul 3M NaOH 至洗脱液,37度，15分钟。

1g NaOH+8.3ml H2O----3M NaOH

12 加44ul 8M NH4Oac，1ul的糖原（glycogen）及三倍体积（约300ul）冰冷乙醇（100%），负20度过夜。

0.6166g+1ml H2O----8M NH4Oac

第三天

13 4度离心4min（14500转/min），以70%乙醇洗沉淀物真空干燥，加30ul H2O，37度促融，-70度冰存