甲基化特异 PCR

甲基化特异 PCR 是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组 DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用 3 对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用 DNA 琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。

甲基化特异 PCR 的基本原理是 DNA 经重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，以处理后的产物作为模板，加入甲基化特异性的引物（primer I）或非甲基化的引物（primer Ⅱ），进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。

器材：

① PCR仪

② 离心机

试剂：

① 基因组 DNA

② 3 mol/L NaOH 溶液

③ 10 mmol/L、pH5.0 对苯二酚

④ 3 mol/L，pH5.0 NaHSO₃

⑤ 3 mol/L NaAc

⑥ 冷乙醇

⑦ TE缓冲液

甲基化特异PCR的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

引物设计的关键在于特异引物的设计。引物序列设计在富含胞嘧啶区域以区别亚硫酸氢钠处理后转化的非甲基化的 DNA 与未转化的甲基化的 DNA，在引物的 3' 端，至少含有 3 个 CpG 位点，以保证区别甲基化与非甲基化 DNA。

野生型引物对直接根据基因组的待测序列设计。甲基化引物对与非甲基化引物对分别根据待测序列的 CpG 位点在经亚硫酸氢钠转化后的序列设计。野生型引物只能扩增出未经亚硫酸氢钠处理的基因片段，甲基化引物对与非甲基化引物对只能分别扩增甲基化与非甲基化的基因片段，由此达到检测基因甲基化的目的。

（二）基因组 DNA 的提取

（1）哺乳动物新鲜组织 DNA 提取

① 切取组织 5 g 左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放人研钵（越细越好）。

② 倒入液氮，磨成粉末，加 10 ml 分离缓冲液（分离缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl pH7.4，10 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA）。

③ 加1 ml 10% SDS，混匀，此时样品变得很黏稠。

④ 加 50 μl 或1 mg 蛋白酶 K，37 ℃ 保温 1~2 h，直到组织完全解体。

⑤ 加1 ml 5 mol/L NaCl，混匀，5 000 r/min 离心数秒钟。

⑥ 取上清液于新离心管，用等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提。待分层后，3 000 r/min 离心 5 min。

⑦ 取上层水相至干净离心管，加 2 倍体积乙醚抽提（在通风情况下操作）。

⑧ 移去上层乙醚，保留下层水相。

⑨ 加 1/10 体积 3 mol/L NaAc，及 2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀 DNA。室温下静置 10~20 min，DNA 沉淀形成白色絮状物。

⑩ 用玻棒钩出 DNA 沉淀，在 70% 乙醇中漂洗后，在吸水纸上吸干，溶解于 1 ml TE 中，-20 ℃ 保存。

⑪ 如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在 5 000 r/min 短暂离心，取上清；如要除去其中的 RNA，可加 5 μl RNaseA（10 μg/μl），37 ℃ 保温 30 min，用酚抽提后，按步骤 ⑨，⑩ 重沉淀 DNA。

（2）细胞中提取 DNA

① 将处理过的细胞弃去培养基，用 PBS 洗绦后用胰酶消化。

② 加入 PBS，收集细胞于15 ml 离心管中。

③ 1 000 r/min 离心 5 min。

④ 弃上清，用PBS重悬，转移至 1.5 ml 离心管中。

⑤ 5 000 r/min 离心 1 min，弃上清，用 1 倍体积的裂解液（含 0.2 mg/ml 蛋白酶 K，150 mmo/L NaCl，40 mmol/L EDTA，10 mo/L Tris-HCl，1% SDS，pH8.0）溶解沉淀。

⑥ 37 ℃ 温浴 6 h。

⑦ 离心（14 000 r/min，5 min，4 ℃），取水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇（25:24:1）。轻轻振摇，10 000 r/min 离心 10 min，重复两次。

⑧ 取水相，加入 NaCl 使终浓度为 140 mol/L 和两倍体积的预冷的无水乙醇混勾。

⑨ -20 ℃ 过夜。

⑩ 离心，用 70% 乙醇洗涤，晾干，加人含 RNA 酶的 TE 缓冲液重新密解。

（三）亚硫酸氢钠修饰 DNA

① 取基因组 DNA 2 μg，用灭菌双蒸水稀释至 50 μl。

② 加入新鲜配制的 3 mol/L NaOH 5.5 μl（终浓度 0.3 mol/L），37 ℃ 水浴 10 min，使 DNA 变性为单链。

③ 依次加入新鲜配制的 10 mmol/L 氢醌（对苯二酚）30 μl 和 3 mol/L 亚硫酸氢钠 520 μl，颠倒、轻柔混匀后，覆盖 100 μl 石蜡油防止液体挥发，避光 50 ℃ 水浴 16 h。

（四）修饰后 DNA 的纯化

① 预热灭菌双蒸水至 80 ℃。

② 使用 Promega DNA Clean Up（A7280）纯化试剂盒纯化 DNA，按照说明书操作。

③ 无菌水 50 pl 洗脱 DNA，12 000 r/ min 离心 1 min。

④ 加入 3 mol/L NaOH 5.5 μl（终浓度0.3 mol/L），室温5 min，终止修饰。

⑤ 加入 10 mol/L乙酸铵 23 μl，中和，以 3 倍体积的冰无水乙醇，-20 ℃ 沉淀 4 h。

⑥ 离心（12 000 r/min，15 min，4 ℃），收集沉淀，晾干。

⑦ 无菌水重悬，-20 ℃ 冻存。

（五）PCR 反应体系和参数

反应体系（50 μl）：10 × PCR 缓冲液 5 μl，25 mmol/L 的 4 种 NTP 混合液 2.5 μl，正向引物（300 ng/μl）1 μl，反向引物（300 ng/μl）1 μl，DNA 模板 2 μl（少于 2 μg），dH₂O 38.5 μl，Tag DNA 聚合酶 1.25 U。

反应参数：95 ℃ 预变性 5 min，加入 Taq DNA 聚合酶 1.25 U；95 ℃ 30 s，引物结合特异温度 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；最后 72 ℃ 终延伸产物 4 min。

1、MSP 的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。

MSP 的引物设计与普通的 PCR 引物设计不同，MSP 的引物设计原理是：模板 DNA 在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域 CpG 岛内 CpG 位点 5'-端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的 CpG 岛内 CpG 位点 5'-端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即 C-U。针对修饰前后的序列差异用 MethPrimer 软件设计甲基化与未甲基化引物，进行 PCR 扩增。MSP 的引物序列中至少含有 1 个以上 CpG 位点，最好是含有多个 CpG 位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高 DNA 启动子甲基化碱基的检出率。MSP 的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的 DNA 序列设计，同时也应该尽可能与普通 PCR 的引物设计原则相符合。按 MSP 的要求，任意 DNA 序列在做 MSP 扩增时，至少要合成 2 对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在 MSP 的未甲基化引物序列中正向引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初设计 MSP 者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到相应的 MSP 引物，可用在线 MethPrimer 软件在线设计引物（网址为 http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html）。根据软件提示可以找到所需要的 MSP 引物。但 MSP 所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其（C+G）含量相对较高，MSP 扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如 Primer 5.0 从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率小于 30% 的引物要进行优化，方法是在核心启动子区域前后反复调整甲基化正向引物打增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高 PCR 产量。

2、DNA 的亚硫酸氢钠修饰

亚硫酸氢钠修饰 DNA 的目的是将 DNA 序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的 5-甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的 pH 值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致 MSP 扩增失败，具体如下：① 亚硫酸氢钠的浓度最好控制在 3.0 ~ 3.9 mol/L，其 pH 值必须用 NaOH 精确调整至 5.0；② 修饰时间应掌握在 10~16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且 DNA 模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；③ 反应温度应控制在 50~55 ℃（若用国产恒温水浴箱建议温度设定在 53 ℃ 为好）；④ DNA 模板量应控制在 <2 μg 为宜。

3、MSP 的反应体系

MSP 的反应体系的成分与普通 PCR 一样 ，反应体系的优化也与普通 PCR 类似，反应体系的优化与普通 PCR 的反应体系中最大的区别是 DNA 模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP 的 DNA 模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求 A260/A280 在 1.8~2.0 之间；含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因 DNA 模板加得太多而导致 DNA 处理不完全致使 MSP 扩增失败；而加的 DNA 模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致 MSP 假阴性。Mg⁺ 浓度一般在 2.0~2.5 mmol/L 为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR 的缓冲液及 Taq 酶的来源也很重要，一般的 PCR 缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的 Taq 酶也会影响结果的重复性。我们建议用 Takara 公司针对富含 CG 等复杂二级结构模板的 TaKaRa LATaq 和 GC 缓冲液效果较好。而一旦选用某一厂家 Taq 酶后，不要轻易更换，以免 MSP 因重新优化而引起的时间和成本的浪费。

4、凝胶电泳分析

MSP 扩增结果时的 3 种情况：① 产物电泳为阴性；② 产物电泳出现多条非特异性条带（含目的基因条带）；③ 产物电泳为阳性（仅目的基因条带）。出现前 2 种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整 MSP 的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR 反应中，Tm 的高低与（C+G）含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现 PCR 偏性。