支原体培养技术

支原体又称霉形体，是很小的原核细胞，完全没有细胞壁．菌体形态多变，具高度多形性，球形、梨形、分枝的或螺旋的丝状等。营养要求苛刻，在高血清量的复杂培养基上生长，在固体培养基上菌落呈油煎荷包蛋样特征性外观。

培养基：牛心汤复合培养基等。分离培养：无菌采取肺、肝、脾、肾组织，直接剪成小块放在固体培养基上划一直线，再用无菌铂耳环在与其垂直方向划线，或者将组织块剪碎磨成匀桨，经液体培养基连续系列稀释后培养．若当液体材料为牛乳、排泄物、胎液等。

可直接取0.2ML接种于液体培养基或取0.1ML接种于固体培养基。固体琼脂平板置37摄氏度潮湿需氧条件或在５％二氧化碳下培养48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立体显微镜检查,若有特异菌落出现,应选取散在的单个菌落用无菌解剖刀切下小琼脂块,用巴氏吸管小心地将菌落和周围琼脂吸入。

再将其移入盛有2-3ML的液体肉汤培养管培养48h,将其培养物通过0.45微升孔径大小的滤膜过滤后作1:10和1:100稀释,每一个稀释液取0.05ML涂布于几个琼脂平板,即可得到纯的支原体培养物。

牛心汤复合培养基：

　　牛心汤1000ml

　　蛋白胨10g

　　氯化钠5ml

　　酵母提取液10ml

　　无菌马血清200ml

　　1.25%醋酸铊溶液20ml

　　青霉素200IU/ml

实验 支MP 肺炎支原体培养实验

一、标本采集

支原体常侵及人和动物的粘膜表面，一般可用棉花拭子涂抹取样后放入2~3ml支原体液体培养基的小管中，或取其分泌液，若标本是组织块，可在灭菌乳钵或玻璃匀浆后接种，取样后应尽快接种培养。

二、分离培养

1、支原体固体培养基接种法 转动拭子将标本液体尽量挤出，用无菌滴管吸1~2滴接种在平皿上盖好，用L棒涂抹或倾斜转动平皿使标本均匀分布，置37℃孵育。

2、支原体半固体培养基接种法 混种法：在制备半固体培养基时，培养基加热溶化，温度降至50℃时，添加动物血清、酵母浸液及青霉素后混匀，待冷却至37~40℃时，用无菌滴管吸取标本0.5~1ml加入培养基中，充分混匀，凝固后置37℃孵育。

3、穿刺接种法：方法同细菌接种法。

三、结果观察

　　绝大多数支原体为兼性厌氧，少数在含10% CO2和相对湿度80~90%的大气环境中生长良好。支原体生长缓慢，多数于3~4d长出菌落，少数于1~2w方长出典型菌落，在平皿固体培养基上生长的菌落呈"油煎蛋"状，边缘不整齐。

四、附录

　　糖酵解培养基（肺炎支原体培养基）
　　基础培养基 70ml
　　马（或牛血清） 20ml
　　25%酵母浸液 10ml
　　0.4%酚红 0.5ml
　　1%醋酸铊 2.5ml
　　青霉素10000IU/ml 5.0ml
　　调pH 7.8
　　肺炎支原体培养很简单的，特别是液体培养，不需要防护！
　　配方上面的有点复杂而模糊，简单：
　　PPLO 21g（商品化买）
　　酵母粉 6g（OXIDE）
　　马血清 200ml（没有的话用小牛血清代替）
　　L－半胱氨酸 0.3g
　　葡萄糖 10g
　　1%酚红 4ml
　　AMP 若干（0.1－0.2g，多加点不影响，但醋酸铊有毒性的，我不加）
　　这些够了，我有时还加SMZ和TMP！
　　ph要调的，大概在7.5－7.6之间吧！
　　酚红可以高压的！