支原体基本知识和检测方法：支原体培养技术！
北京百欧博伟生物技术有限公司
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支原体基本知识和检测方法：支原体培养技术！
支原体又称霉形体，是很小的原核细胞，完全没有细胞壁．菌体形态多变，具高度多形性，球形、梨形、分枝的或螺旋的丝状等。营养要求苛刻，在高血清量的复杂培养基上生长，在固体培养基上菌落呈油煎荷包蛋样特征性外观。
培养基：牛心汤复合培养基等。
分离培养：无菌采取肺、肝、脾、肾组织，直接剪成小块放在固体培养基上划一直线，再用无菌铂耳环在与其垂直方向划线，或者将组织块剪碎磨成匀桨，经液体培养基连续系列稀释后培养．若当液体材料为牛乳、排泄物、胎液等，可直接取0.2ML接种于液体培养基或取0.1ML接种于固体培养基。固体琼脂平板置37摄氏度潮湿需氧条件或在５％二氧化碳下培养48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立体显微镜检查,若有特异菌落出现,应选取散在的单个菌落用无菌解剖刀切下小琼脂块,用巴氏吸管小心地将菌落和周围琼脂吸入,再将其移入盛有2-3ML的液体肉汤培养管培养48h,将其培养物通过0.45微升孔径大小的滤膜过滤后作1:10和1:100稀释,每一个稀释液取0.05ML涂布于几个琼脂平板,即可得到纯的支原体培养物。
牛心汤复合培养基：
牛心汤1000ml
蛋白胨10g
氯化钠5ml
酵母提取液10ml
无菌马血清200ml
青霉素200IU/ml
实验之MP肺炎支原体培养实验方法：
一、标本采集
支原体常侵及人和动物的粘膜表面，一般可用棉花拭子涂抹取样后放入2~3ml支原体液体培养基的小管中，或取其分泌液，若标本是组织块，可在灭菌乳钵或玻璃匀浆后接种，取样后应尽快接种培养。
二、分离培养
1、支原体固体培养基接种法 转动拭子将标本液体尽量挤出，用无菌滴管吸1~2滴接种在平皿上盖好，用L棒涂抹或倾斜转动平皿使标本均匀分布，置37℃孵育。
2、支原体半固体培养基接种法 混种法：在制备半固体培养基时，培养基加热溶化，温度降至50℃时，添加动物血清、酵母浸液及青霉素后混匀，待冷却至37~40℃时，用无菌滴管吸取标本0.5~1ml加入培养基中，充分混匀，凝固后置37℃孵育。
3、穿刺接种法：方法同细菌接种法。
三、结果观察
绝大多数支原体为兼性厌氧，少数在含10% CO2和相对湿度80~90%的大气环境中生长良好。支原体生长缓慢，多数于3~4d长出菌落，少数于1~2w方长出典型菌落，在平皿固体培养基上生长的菌落呈"油煎蛋"状，边缘不整齐。
四、附录
糖酵解培养基（肺炎支原体培养基）
基础培养基 70ml
马（或牛血清） 20ml
25%酵母浸液 10ml
0.4%酚红 0.5ml
青霉素10000IU/ml 5.0ml
调pH 7.8
肺炎支原体培养很简单的，特别是液体培养，不需要防护！
配方上面的有点复杂而模糊，简单：
PPLO 21g（商品化买）
酵母粉 6g
马血清 200ml（没有的话用小牛血清代替）
L－半胱氨酸 0.3g
葡萄糖 10g
1%酚红 4ml
AMP 若干（0.1－0.2g，多加点不影响）
有时还加SMZ和TMP！
ph要调的，大概在7.5－7.6之间吧！
酚红可以高压的！
北京百欧博伟生物技术有限公司的中国微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！
http://www.biobw.org/
支原体又称霉形体，是很小的原核细胞，完全没有细胞壁．菌体形态多变，具高度多形性，球形、梨形、分枝的或螺旋的丝状等。营养要求苛刻，在高血清量的复杂培养基上生长，在固体培养基上菌落呈油煎荷包蛋样特征性外观。
培养基：牛心汤复合培养基等。
分离培养：无菌采取肺、肝、脾、肾组织，直接剪成小块放在固体培养基上划一直线，再用无菌铂耳环在与其垂直方向划线，或者将组织块剪碎磨成匀桨，经液体培养基连续系列稀释后培养．若当液体材料为牛乳、排泄物、胎液等，可直接取0.2ML接种于液体培养基或取0.1ML接种于固体培养基。固体琼脂平板置37摄氏度潮湿需氧条件或在５％二氧化碳下培养48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立体显微镜检查,若有特异菌落出现,应选取散在的单个菌落用无菌解剖刀切下小琼脂块,用巴氏吸管小心地将菌落和周围琼脂吸入,再将其移入盛有2-3ML的液体肉汤培养管培养48h,将其培养物通过0.45微升孔径大小的滤膜过滤后作1:10和1:100稀释,每一个稀释液取0.05ML涂布于几个琼脂平板,即可得到纯的支原体培养物。
牛心汤复合培养基：
牛心汤1000ml
蛋白胨10g
氯化钠5ml
酵母提取液10ml
无菌马血清200ml
青霉素200IU/ml
实验之MP肺炎支原体培养实验方法：
一、标本采集
支原体常侵及人和动物的粘膜表面，一般可用棉花拭子涂抹取样后放入2~3ml支原体液体培养基的小管中，或取其分泌液，若标本是组织块，可在灭菌乳钵或玻璃匀浆后接种，取样后应尽快接种培养。
二、分离培养
1、支原体固体培养基接种法 转动拭子将标本液体尽量挤出，用无菌滴管吸1~2滴接种在平皿上盖好，用L棒涂抹或倾斜转动平皿使标本均匀分布，置37℃孵育。
2、支原体半固体培养基接种法 混种法：在制备半固体培养基时，培养基加热溶化，温度降至50℃时，添加动物血清、酵母浸液及青霉素后混匀，待冷却至37~40℃时，用无菌滴管吸取标本0.5~1ml加入培养基中，充分混匀，凝固后置37℃孵育。
3、穿刺接种法：方法同细菌接种法。
三、结果观察
绝大多数支原体为兼性厌氧，少数在含10% CO2和相对湿度80~90%的大气环境中生长良好。支原体生长缓慢，多数于3~4d长出菌落，少数于1~2w方长出典型菌落，在平皿固体培养基上生长的菌落呈"油煎蛋"状，边缘不整齐。
四、附录
糖酵解培养基（肺炎支原体培养基）
基础培养基 70ml
马（或牛血清） 20ml
25%酵母浸液 10ml
0.4%酚红 0.5ml
青霉素10000IU/ml 5.0ml
调pH 7.8
肺炎支原体培养很简单的，特别是液体培养，不需要防护！
配方上面的有点复杂而模糊，简单：
PPLO 21g（商品化买）
酵母粉 6g
马血清 200ml（没有的话用小牛血清代替）
L－半胱氨酸 0.3g
葡萄糖 10g
1%酚红 4ml
AMP 若干（0.1－0.2g，多加点不影响）
有时还加SMZ和TMP！
ph要调的，大概在7.5－7.6之间吧！
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