［交流］PCR中出现非特异扩增

经常看到许多战友因为PCR的非特异扩增而烦恼，不如我们把我们曾经也遇到过这样问题，经过努力后得到了目的条带的成功经验一起分享。

首先我先把我的消除非特异扩增的方法先贡献出来，请大家多多批评指正。

PCR类型：Long PCR

一、PCR体系

1、酶：Pyrobest DNA Polymerase

2、模板：人类基因组DNA

3、引物：根据已知的DNA序列设计的引物。

4、目的片段长度：约3.5K

（上述四项，我个人认为应当注明，因为许多PCR可能因为这四项不同而导致PCR循环和体系调整有较大的差异，同时希望各位战友在讲自己的经验时也指出，若觉得还有其他要讲明的请也指出。）

5、体系的各成分的终浓度，主要依据我选用酶的厂家所给的标准体系，并参考《分子克隆》中普通的PCR体系。

二、PCR循环

根据厂家提供的标准PCR循环，并参照《分子克隆》结合自己的模板和引物的各项值来设计。

通常我先做梯度PCR，来摸索最佳退火温度。温度设定范围：两条引物的高Tm值+3度和低Tm值-5度之间。

我认为最佳的梯度PCR电泳结果应该是

1、所有的温度只出现一条带；

2、低温出现多条非特异性带，随着温度升高条带逐渐减少，到某一较高的温度所有条带均不出现，或者仅出现单一条带。

结果分析

1、若单一条带为目的条带，万事大吉。若非目的条带，我通常的做法比较极端，就是换引物。

2、若非特异性扩增中无目的条带出现，我的极端做法：换引物。

若非特异性扩增中出现目的条带，可分为以下情况。

a、目的条带的亮度在所有的温度中都比非特异性条带弱，则做如下优化：减少Mg离子的含量、减少dNTP的含量、采用热启动、加入PCR辅助剂DMSO等、切胶回收。（我个人的经验，这些优化通常很难再获得单一的目的条带，我通常如果优化两次不成功，就直接换引物了。）

b、目的条带的亮度在所有的温度中都比非特异条带亮，但即便到了最高温度也没有消除非异性扩增，则做如下优化：做Touch down PCR，通常我认为Touch down解决这一问题成功率比较高。

c、非特异扩增的非目的条带随温度升高而消失，特异性条带仍旧存在。则选用能获得最佳产量和特异性目的条带的退火温度即可。