PCR(聚合酶链式反应)扩增和扩增产物克隆

概 述

PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA的方法。它包括三个基本步骤:

(1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链;

(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;

(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下，以目的DNA 为模板进行合成。

由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍，这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA 扩增达106 倍。

一、 PCR 反应中的主要成份

1、引物： PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR 成败的关键。引物设计和选择目的DNA 序列区域时可遵循下列原则：

(1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。

(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。

(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误引发。

(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。

(5) 在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。

(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。

(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的Met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR 反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可精确计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：

X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩尔浓度，A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。

2、 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)： dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。

一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA 。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA 聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

3、 Mg2+ ： Mg2+ 浓度对Taq DNA 聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR 反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR 反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。

4、 模板： PCR 反应必须以DNA 为模板进行扩增， 模板DNA 可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。就模板DNA 而言，影响PCR 的主要因素是模板的数量和纯度。

一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA ，10ng的酵母DNA ，1ng的大肠杆菌DNA 。扩增多拷贝序列时，用量更少。灵敏的PCR 可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA 中分析目的序列。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA 中的杂质也会影响PCR 的效率。

5、 Taq DNA 聚合酶： 一般Taq DNA 聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min， 97℃ 5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA 聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。Taq DNA 聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。

Taq DNA 聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR 中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR 克隆 和进行序列分析时尤应注意。在100μl PCR 反应中，1。5-2单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA 、引物及其它因素的变化进行适当的增减。

酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA 聚合酶， 灭活Taq DNA 聚合酶的方法有：

(1) PCR 产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。

(2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。

(3) 99-100℃加热10min。目前已有直接纯化PCR 产物的Kit可用。

6、 反应缓冲液： 反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8。3-8。8)， 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。 Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR 反应中，pH为6.8-7.8。

50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA 片段有利。各种Taq DNA 聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。