聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

概 述
　　PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
　　一、 PCR反应中的主要成份
　　1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。
　　2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
　　3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。
　　4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
　　5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
　　6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris・Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ . Tris・Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
　　二、PCR反应参数
　　1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
　　2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃-55℃,1-2min。
　　3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
　　4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。
　　扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为增效率, n为循环次数。
　　在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。
　　三、PCR产物的克隆
　　在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。
　　1. 平末端连接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。
　　2. 在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。
　　3. 粘性末端连接：利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。
第二节 材料、设备及试剂
　　一、材料
　　不同来源的模板DNA。
　　二、设备
　　移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。
　　三、试剂：
　　1、10×PCR反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris・Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。
　　2、MgCl2 ：25mmol/L。
　　3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。
　　4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
　　5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液：配方见第五章。
　　6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。
　　7、其它试剂：矿物油（石蜡油），1% 琼脂糖，5×TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70％ 乙醇。
第三节　操作步骤
　　一、PCR反应
　　1. 依次混匀下列试剂
　　　35μl H2 O
　　　5μl 10×PCR反应缓冲液
　　　4μl 25mmol/L MgCl2
　　　4μl 4种dNTP
　　　0.5μl 上游引物（引物１）
　　　0.5μl 下游引物（引物２）
　　　0.5μl 模板DNA(约1ng)
　　混匀后离心5秒。
　　2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5μl约2.5U），混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
　　3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
　　二、电泳
　　按第二章所述,取10μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
　　三、PCR产物的纯化
　　扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
　　（一）酚/氯仿法
　　1.取反应产物加100μl TE.。
　　2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。
　　3.再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。
　　4.在水相中加300μl 95％乙醇,置-20℃下30min沉淀。
　　5.在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1ml 70％乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。
　　（二）Wizard PCR DNA纯化系统
　　Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。
　　该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：
　　　50ml Wizard PCR DNA纯化树脂
　　　5ml 直接提取缓冲液
　　　50支 Wizard微型柱
　　1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。
　　2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
　　3、加1ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
　　4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
　　5、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 80%异丙 醇，对微型柱进行清洗。
　　6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
　　7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。
　　8、丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。
　　[注意] 1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。
　　　　　　2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。
　　四、载体加dT尾
　　1.将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
　　2.在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。
　　3.加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。
　　4.按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
　　5.加入2倍体积 95％乙醇,在-20℃下沉淀1hr。
　　6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
　　五、PCR产物与载体粘末端连接
　　1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。
　　2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
　　3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
　　六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
　　1. 在50ml的PCR产物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混匀。
　　2. 37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。
　　3. 用酚:氯仿抽提2次。
　　4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。
　　5. 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1ml （约0.1mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ，连接缓冲液1ml 。
　　6. 取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
　　[注意]1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
　　　　　2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
　　　　　3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
　　　　　4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。