lipofectamine 2000脂质体转染293ft细胞经验

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293细胞 总有一种转染方法适合你

问： 我用lipofectamine 2000转染 293ft细胞，细胞老是死亡，是什么原因?求各位先知不吝赐教。我的protocol如下：

Day 0：细胞传代后计数、seed 2.0x105Cell s and 1.0x106 cells per well of plate

Day 1：细胞达到70%汇合后准备:溶液1：200ul 无血清培养基 + 4 ul lipofectamine 2000 per well

溶液2：200ul 无血清培养基 + 1 ug GFP per well

将溶液1与溶液2混合，室温下置30min后加入600ul无血清培养基;PBS 冲洗细胞后每well加入500ul 混合的溶液。

Day 2：18小时后用PBS 冲洗细胞，加入含10%血清的培养基。隔天观察细胞绿色荧光。

但是做到Day 1的时候，即加入lipofectamine后细胞就死亡了，后来老板说可能时间太长了，改18小时为4小时，但293ft细胞还是死亡。

目前我人在德国做实验，德文的文献看不懂，所以请教各位不吝赐教!

答1： 脂质体量多了,我们用说明书上的一半量,效果很好,但是质粒 要先测浓度.还有可能是时间久了,一般4-6小时后就要到掉脂质体,换为有血清和双抗的培养基，并且要用无双抗血清的培养基孵育lip5分钟以上

答2： 建议用磷酸钙系统转染.通常293都是用该系统转染的,且效率很高,但要注意防止污染.2005年的Nature methods上有经典步骤.祝顺利!

答3： 我个人也碰到类似的情况，曾与INVITROGEN的技术支持反映过此问题，对方的回应【原始邮件没有找到】认为主要是lipo2K的毒性问题，其中特别强调了：

1. 取lipofectamine 2000时，一定要将lipofectamine 2000轻轻混匀，以确保你吸取的lipofectamine 2000浓度是正确的，不会过高或过低。当没有混匀，虽然你吸取的是4ul，但由于你吸取的lipofectamine 2000浓度可能较高，会造成严重的细胞毒性;

2. 细胞密度问题：说明书上建议是细胞达到90%左右汇合时进行，这样可以减少lipo2K的毒性。如果细胞密度较低，如70%，会造成较为严重的毒性，而使细胞死亡。

同时个人建议：

1. 由于293的转染效率非常高，细胞生长也非常旺盛，因此，打到95%左右汇合时转染，可能时比较高的平衡点(细胞毒性与转染效率的平衡点)

2. 转染时间4h没问题。

3. 你没有说你是用什么培养板，500ul/well，可能是24well-plate。如果不是，应该按说明书进行，英文版的说明书可以在invitrogen上下载;

4. lipo2K转染时的培养基是可以含血清的，如果上述建议仍然无效，你可以试试，将“转染混合液”加入含有血清的培养基培养的293细胞孔中。【配制转染混合液还是用无血清的，最好是opti-mem。

如果是6孔板，你转染混合液加入的是每孔500ul，这样的体积对6孔板而言，几乎是可以覆盖细胞单层的下限，有可能会造成孔中央的细胞缺乏培养基。因此，建议你还是按说明书的来，2ml/well。

在你没有得到好结果前，我个人觉得要认真按说明书进行，而不要根据自己的臆想进行所谓的优化实验，更改参数。