细胞培养经验

1.如果财力允许，培养基一定要买已经配好的，因为ph值对细胞影响很大，并且很多时候对于新手来说，即使细胞培养失败你是找不出合理的理由的。所以尽最大可能减少不稳定因素的影响！

2.我通过实践证明培养基最好是DMEM与1640混合再一起使用，比例大概就是1：1,这样你会发现即使培养多种细胞你只需这一种培养基就可以完全应付了！

3.我总体认为培养基最好不要加抗生素，首先它对细胞有影响，其次很容易失效。其实我们细胞室相当简陋，并且应用的人还是很多的。

4.灭过菌的东西最好是一周内使用，超过时限就需要再一次灭菌！！！

5.对待细胞的态度一定好，这样它才会好好对你。

6.还是关于培养基，如果不是买液体的，那么其ph问题一定要给予充分重视！！！配置过程中的调解我就不说了，能用ph计最好！

7.其次关于培养基的保存，如果你有输液瓶，那么我建议你每一次打开以后，最好还是换一个胶塞。如果象我一样就是普通培养瓶，那么记得一定要用封口膜封口，不要担心封口膜会带来更多的污染！你可以先将封口膜在使用前开紫外时略微照一下！但是保存封口膜最好找一个密封的瓶子等，比如吃完糖的罐子。

8.培养基中最好还是加好所需血清保存，这样使用比较方便。当然不是所有的培养基，而是2周左右可以使用完的量啊！

9. 细胞传代的时候胰蛋白酶量要做到最少但是有效果就可以，这样对细胞的伤害时最小的。我一般加入的量恰好将将够铺满整个瓶底。

另外消化完成也就是晃动瓶子时有沙粒状大片脱落，需马上加入含有血清的培养基中止消化！有人这样直接传代，我认为效果不是很好，因为这时血清被用来种子胰酶且瓶中还有胰酶损伤的细胞，所以我还是一贯主张离心完在传代。

10.既然说到了离心，那么一定要平衡你的培养瓶。关于离心机平衡的重要性我应用下面这个帖子吧。

11.离心完以后去掉旧的培养基，加入新鲜培养基（含血清）。然后用滴管一定要吹打均匀在传代！！！

12.一般来说细胞最好在一分钟之内复苏完毕，也就是将原来冻存好的细胞在37度水浴条件下融化，但是就我个人而言，一个人在液氮罐中拿出细胞然后在1分钟之内复苏还是有困难的，只能说尽量快！！！

13.这里面必须强调的是水温，最好不要超过40度，温度太高对细胞影大。

14.必须保证水浴锅水是干净的。一般我喜欢里面放一个干净的小烧杯，然后用干净的镊子夹着冻存管。

15.将冻存管拿到超净台里面以后，先用酒精棉球擦净外面的水和其他东西保证干净无菌！！！这时候最好不要将冻存管过火，因为很容易烧坏冻存管损伤细胞的。

16.我一般不离心，加入将近10倍量的培养基在细胞贴壁以后大概6h左右换液即可。

17.充分判断传代的时机了，一般来说至少长到80％左右（我一直在培养肿瘤细胞）。我一般是2～3天就能传了。记住细胞可以完全张满瓶底甚至已经重叠在传，但是最好不要还没有长到一定的规模就传代！

这样很容易损伤细胞，当然不同的细胞不好用时间来限制，但是一定要显微镜下观察好了在决定是否传代。需要注意的是最好使用pbs先清洗一下细胞，以消除原来培养液种血清的干扰胰酶。

18.般来说传代前一天或者上午至少应该更换半量培养基，这样可以保证传代的细胞仍然保持旺盛的生命力，使其不会因传代受到更大的损伤。

19.于传代是否使用胰酶，我想因细胞各异。如果使用胰酶，我建议的量一般是600ul左右，这个是指100ml玻璃培养瓶，肿瘤细胞而言，一般就是刚刚可以将瓶底覆盖为好。胰酶量不要过大，以免对细胞损伤过大。

20 肉眼观察在轻轻晃动培养瓶的时候发现细胞呈沙粒状一片一片的滑落开始中止消化，我一般直接加入含有血清的培养基，然后滴管轻轻吹打混匀，转移至玻璃离心管，800rpm，6分钟左右。离心结束即可看见大量白色细胞聚集在离心管底部。

21.离心以后弃掉旧的培养基，换新培养基，然后吹打混匀。一般一瓶细胞数量是600万左右，也就是undefined106个，但是我平时传代是不计数的，只有铺板的时候才计的，但是凭经验而言，一瓶传2瓶是没有任何问题的。这里需要指出的是，原来培养细胞的瓶子如果你操作得当还是可以继续使用的。这就为我们这些重复使用培养瓶的人减轻一部分劳动啊！

22.般而言传代24h后最好换一下培养基。虽然细胞在4h左右基本可以完全贴壁，但是我们还是需要让他在这个初始环境下生长适应一下。

23.觉得尤其是新手，恐怕第一关就是清洗培养用品了。一般而玻璃用品最好的办法就是充分泡酸，就是硫酸和重铬酸钾一定比例的洗液。时间来的及就尽量多放一段时间，特别管用的。但是要记住将瓶子内部充满洗液，并且充分接触。

24.过洗液的瓶子等玻璃仪器，包括离心管和胶头滴管等，这时候就要用自来水冲洗，直到没有洗液残留；接下来就是蒸馏水冲洗了，整个过程至少是5次吧，自己感觉就可以了，一定记得带上橡胶手套啊。

25.干净的瓶子等放入烘箱干燥，最好是带有鼓风的烘箱，而不是真空的啊！这样可以节省好多时间。

26.瓶子干了以后，用铝箔或者牛皮纸扎紧瓶口，在鼓风烘箱中160-18度干法灭菌4h，这里的4h一般是指温度升到160度左右开始的，而不是指放入烘箱哪一刻就开始计时。

这里特别注意灭菌结束以后不要立刻打开烘箱门，以免质量差的瓶子突然接触冷空气而炸裂伤人。而是等到烘箱降温到身体可以接受的温度在将其拿入细胞室，这样灭菌的瓶子至少可以使用10天的。当然一定将瓶口扎紧啊！！

27.实验中，也有人使用灭菌锅灭菌玻璃瓶子等，这也能达到灭菌要求，但是高压灭菌结束干燥的时候不是很容易！我推荐使用干法灭菌。

28.这里需要指出的胶头滴管的灭菌是，将其放入到不锈钢杯中，一般很容易定做的。杯子下面放好用纱布包好的棉花，滴管上边用棉花塞好，不要特别紧以免滴管不好用；也不能特别松，要不会将棉花吹落的，具体多少，实验过程中自己体会啊！

29.璃离心管灭菌方法和培养瓶方法是一样的，但是就是用饭盒或者别的器皿装好离心管，这里的离心管也是包扎好瓶口的。

30.先回答楼上kaitangke 的问题，这种情况我也是建议你将其消化下来培养，但是从你描述的情况很又可能是瓶子不是一次性的，那么玻璃瓶就存在刷洗的时候用力不均匀可能存在划痕的问题！！！显微镜下观察像麦子一样，一条条的。这样就造成了你的细胞生长不均匀，部分地区出项重叠，部分地区不生长，所以我还建议你消化下来再还一个培养瓶！！！这里再建议大家刷洗玻璃瓶子的时候将一个细铁丝前端裹好纱布再刷洗，瓶子内部就会很少出现划痕，并且刷洗的彻底！！！

31.关于塑料仪器，无非就是瓶盖和滤器，还有就是一些玻璃离心管盖子和胶头。

我分开说：

首先：滤器一般使用完以后（重复使用的，0.22um），有条件的最好使用超声超一下，干净的自来水就可以，然后放入我们的5％盐酸溶液中，有人使用1%，我习惯5%至少是过夜以后，再将其拿出先自来水然后蒸馏水洗净，干燥，高压灭菌。

灭菌的时候我是使用饭盒直接装好灭的；也有人用牛皮纸包好再灭，但是我觉得使用时多了拆开这一步，不是很方便，所以用饭盒就可以了，一直效果不错。

32.其次说说培养瓶盖子还有离心管盖子，一般来说这些盖子使用完以后，先将其泡到5％盐酸溶液中过夜，然后拿出先自来水然后蒸馏水洗净，干燥，高压灭菌。同样，我是使用组培的那些塑料罐子装好灭菌的，不好描述它的形状，大家问问做组织培养的人吧。

33.至于胶头处理方法有些不同，就是泡酸拿出自来水，蒸馏水洗净以后不能灭菌！！！因为高压会使胶头损坏！！！！！所以洗净以后也是用干净的组培的那些塑料罐子装好，记得不要盖紧，直接使用紫外照一下就可以了。至少30分钟！！！我一般使用前还会用75%酒精擦拭一下，并且过火的。并且重复使用，就是这些胶头，如果不是掉在地上，或者撒上培养基血清等，我就放在超净台里的。

34.这里需要特别指出的是酒精灯的酒精可以使用工业酒精，就是植物化学冲洗柱子用的那些，但是超净台里用来消毒的75%酒精最好使用无水乙醇配制！！！莫因小失大！！！

35.其实上面说的塑料仪器都是使用过的，一般如果是新买来的瓶盖等，还有一个过程必不可少就是将其泡在还有洗涤剂的水中，时间不要太短，好好洗洗上面的脏物，同样如果有条件最好还是超声一下！！！然后自来水冲去洗涤剂，干燥一下再泡酸过夜，然后方法入上面。然后移液管，就是分装血清或者培养基的，原来我也是使用一次性的。现在时间长了，我觉得最好的办法是直接倾倒！！！千万不要害怕会撒掉，只要精神集中，并且到过几次，会发现这样真是省事省力，并且不容易污染效率。

MTT实验

1.应该明白这个实验的原理（论坛里面很多，不重复），简单一句话就是：只有活细胞才能与mtt反应，并且能够产生有紫外吸收的晶体，也就是吸收度反应的是活细胞的相对数量，而不是绝对数量！！！

2.做mtt的准备：应该先设计好实验，比如药物浓度，还有接种密度和接种体积，这2点相当重要。因为你设定的药物浓度有可能不是你最终的作用浓度（如果你不换液的话），并且需要注意接种密度太大，很可能让你的实验一塌糊涂；如果你的接种密度太低，也有可能产生假阳性，造成盲目的乐观啊！还有就是给药时间，这个你应该在充分掌握你自己细胞生长装态的情况下确定，当然有条件的可以做个流式或者细胞生长曲线来定！总之要谋定而后动。

3.于配药，我主要想说的是极性小的药物，也就是水溶性或者培养基基本不溶的样品，那么需要加入有机溶剂，这时你就必须设定阴性对照，依据给药组的有机溶剂最大含量对阴性对照组给予相应的有机溶剂。举个例子：假设1mg药物溶解于500ulDMSO，然后稀释到5ml，那么你相应的阴性对照组DMSO的含量就应该是500ulDMSO/5ml。