蛋白纯化反相柱的选择

HP-RPC的选择首先要看蛋白质的分子量，20kDa左右的一般用C4或C8，再小一点的可以用C18，太大的蛋白并不适于反相分离。C18通用性最好，但是有时候保留过强可能会导致收率较低。如果目的蛋白不是很针对，可以考虑通用性最强的C18柱。

一般来说，4.6mm的内径比较常见，250mm长的柱子比150mm的柱子分离度要好，无论对小肽还是蛋白都是这样。

其次要注意填料的孔径，80A左右的填料主要是用于小分子的分析分离，对于蛋白这样的大分子，要用300A孔径的填料，可以避免分子扩散到填料内部的摩擦阻力，提高柱效。此外C载量来说，蛋白柱和一般的C18也是不一样的。

Agilent, Waters，Vydac都有相关的成熟产品，最好能配备相应的保护柱。

更小内径的柱子可以节省流动相，有些更适于甲酸等液质连用的情况。

制备的话，还是考虑聚合物的制备级填料Source RPC比较好，可以NaOH CIP。Amersham也有ReSource的聚合物反相分析柱卖，寿命会长些，该柱非极性与C8相近，但是价格较贵，印象中要RMB 8000。

一般的进口柱连同保护柱，RMB4000差不多搞定了。

太大分子量的蛋白用Source RPC分离收率也一样不会高的，不过对于硅胶C18系列分析柱，柱子寿命更重要，为了防止堵柱，自然，厂家会强调如何根据蛋白性质来选合适的柱，以尽量延长柱寿命为自己产品赢得口碑。

对于安马西亚的Source RPC，它的非极性和C8的蛋白柱相近，这一点是明确的，但选择性不同。Source柱可以CIP再生，所以寿命不是问题，就是沉淀了活是洗不下来也不用担心，用浓酸碱再生就是了，所以也用不着强调分子量范围，而只是说和C8的非极性相似。一般的SOURCE RPC的载量是用胰岛素标称的，可见主要用于小蛋白的分离。

对于C18柱，配合相应的保护柱应该可以适用于大部分的应用，收率可能低，但是有保护柱保护，柱子一般不会坏就是了。一般进口的要RMB4000(including guard cartridge)，TSK不知道有没有，不过TSK的柱质量肯定不如Waters或Agilent/vydac，便宜也便宜不了多少。

对于分离而言，Source 和C18相比，没有明显的优势；但是前者寿命长，不怕堵塞，压力低，设备会便宜，可以自己填装，容易放大。

不同的填料和蛋白活性没有直接联系，但是非极性强（保留强）的柱子更容易使蛋白变性，比如C18比C8更容易使蛋白变性，因为蛋白容易变性，有的甚至沉淀，所以对柱子的寿命会有影响，所以能用C8就尽量不要用C18。

以硅胶反相柱为例，太大的蛋白无法进入小的孔径，无法利用孔径内的配基位点，因此分离效果不会很好，但也不绝对，要看杂蛋白的情况。如果分子量不是太大，那可以试试看再说，最好有 保护柱 。

Source柱的非极性和C8相近，一般也足以使蛋白保留了。可以放心的试，不用担心蛋白沉淀对柱的寿命产生影响。

常见的C8,c18都是硅胶基质的反相填料。这种填料比较耐压，但是pH范围较窄，一般为2~7，以免硅胶水解或配基脱落。处理的话看说明书即可，要注意极性和非极性溶液之间的过渡就可以了，一般 分析柱 不要反冲。

如果是普通的层析硅胶，那还是属于正相层析，因为硅胶本身是极性的，一般不用于分离蛋白。同样也要注意溶液间的置换。