原代CEF的制取

1.纯化病毒第一步

剪碎法CEF的制备

实验前准备

PH7.2 PBS（SW配）﹑平皿一小包（３个）﹑饭盒１（器械，玻璃漏斗）﹑饭盒2（纱布）﹑离心管、碘酊﹑废液缸﹑0.1%新洁尔灭溶液﹑0.25%胰酶﹑９日龄ＳＰＦ胚２﹑Ｍ１９９培养基

实验步骤

1）首先SPF胚新洁尔灭溶液表面消毒，再碘酊﹑酒精消毒，最后小心敲破气室

2）准备两把眼科弯头镊子，一把撕破尿囊膜和羊膜，另一把夹鸡胚。用镊子把鸡胚取出，浸泡于已倒入PBS的平皿中①去爪②去内脏

3）把鸡胚从平皿中取出，置于另一含PBS的平皿中，再一次洗涤

4）重复上述步骤

5）把鸡胚移至５０ml小烧杯内，小剪子剪成肉泥

6）把肉泥吸入离心管中，如出现肉块较大，可继续剪，直至全部肉泥吸入离心管中。在离心管中加入PBS,洗３次。上清由红至清

7）加入８ml0.25%胰酶消化，肉泥由块状→絮状（胰酶pH7，于37℃水浴中预热）

8）加入Ｍ199培养基终止，注意在加入培养基后轻轻混匀，切勿吹打

9）静置沉淀后，尽量多地弃去上清，加入Ｍ199培养基，吹打，使cell掉落

10）拿一cell培养瓶，在过滤前先用M199润湿纱布，吹打静置沉淀后吸上清，把上清加入装有４层纱布的漏斗中过滤。

11）继续加Ｍ199培养基吹打，静置沉淀吸上清过滤，直至加入的Ｍ１９９培养基吹打后不混浊为止。

13）细胞台盼蓝染色计数，细胞分瓶，每瓶装７００万细胞，此方法每胚约能分两瓶。

剪碎法CEF的制备缺点是获得的细胞量较少，优点是细胞活力高。连续消化法优点是获得的细胞量大，缺点是细胞活力小。

在CEF制取好后，是病毒的侵染和固定细胞的维持最后是染色