转染

细胞传代

(1) 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

(2) 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

(3) 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟（37。C，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

(4) 加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5) 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

(6) 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

(8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

(9) 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

细胞转染

1）转染试剂的准备

A. 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。

2） 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

5） 将混合液在室温放置10―15分钟。

6) 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

7） 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

8） 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

第二次细胞传代

1）在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

2）再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。

3） 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。