抗TCR介导的CTL活性酯酶分析法

细胞毒性T细胞对靶细胞杀伤的主要机制是通过释放的穿孔素-颗粒酶系统介导的溶靶细胞作用或通过fas/fasL系统介导的细胞凋亡作用。因此，对CTL颗粒酶的胞泌作用分析可反映细胞毒性T细胞功能。该方法操作简便且无需靶细胞作为指示细胞。

一、基本原理

应用直接针对TCR的单克隆抗体，模拟特异性靶细胞的作用，诱导CTL细胞内颗粒丝氨酸酯酶等的释放。抗TCR可与CTL细胞表面TCR的α和β链及CD3复合物特异性结合。

该法基本过程是，先用单克隆抗体包被微孔板，然后加入CTL或T淋巴细胞，经一定时间作用后，CTL被活化，收集培养上清液，加入含DTNB的缓冲液（底物为BLT），采用分光光度计检测酶的活性，并计算抗TCR诱导的酯酶释放百分率。

二、试剂及材料

1. pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液（PBS）；

2. 抗TCR单克隆抗体（用PBS配成5μg/ml）

3. BLT底物溶液：临用前配制：500μl20mmol/LN-α-苯氧羰基-L-赖氨酸硫代苯甲酯（BLT）贮存液，500μl 22mmol/L 的5，5二硫对硝基苯甲酸（DTNB）贮存液，500μl1％TritonX-100，48.5mlPBS。其中各成分的最终浓度分别是：BLT 0.20mmol/L；DTNB 0.22mmol/L和TritonX-100为0.01%。

4. 0.1mol/L苯甲烷磺酰氟化物（phenymethanesulfonyfluorid，PMSF）的二甲亚砜溶液（注意：PMSF剧毒，使用时应注意安全）。

三、操作方法

1. 将抗TCR单克隆抗体50μl（5μg/ml，抗体刺激孔）或缓冲液50μl（未处理或背景孔）加入96孔细胞培养板，室温放置30min以上，以使抗体致敏；

2. 弃去孔中液体，并用50～100μl完全RPMI-1640培养液洗孔，弃去孔中的全部液体，加入50μlCTL（105个），补加入50μl完全培养液；并设颗粒酶总释放对照孔（50μlCTL+40μl完全培养液+10μl1％TritonX-100）和背景孔（50μlCTL+50μl完全培养液），各孔最终体积为100μl；均设三复孔；

3. 于37℃，5％CO2温箱培养4h；

4. 将培养板置吊篮上，4℃，1100r/min离心5min，吸取50μl培养上清液转入12×75mm试管中，加入950μl新鲜配制的BLT底物应用液，37℃水浴20min；

5. 将上述处理的试管一起置冰浴中，并立即加入0.1mol/L的PMSF 10μl，补加1.0mlPBS使终浓度达0.05mol/L（PMSF是一种不可逆的丝氨酸酯酶抑制剂）；

6. 于分光光度计上测定412nm波长下的吸光值。

四、结果分析

按下式计算抗体诱导的颗粒酯酶分泌百分率；

颗粒酯酶分泌百分率（％）=100×（E-B）/（T-B）

式中“E”为抗体刺激的CTL细胞上清液平均吸光值；“B”表示背景或未处理的CTL细胞孔平均吸光值；“T”表示酶总释放量（即用TritonX-100处理的CTL细胞上清）。其中代表酶自发释放的“B”值一般应该是“T”值的5％～10％以下。