TCR人源化动物模型

（一）HLA人源化小鼠

自1981年转基因技术发明后不久,第一代HLA转基因小鼠就诞生了。这一代HLA转基因小鼠使用人类的HLA-A2或HLA-B27分子,小鼠的MHCI类分子没有敲除。

研究发现小鼠T细胞偏向使用小鼠的MHC分子如Db和Kb分子；病毒感染时,只产生H2限制的CTL反应。

第二代HLA转基因小鼠用HLA和CD8双转基因,或将HLA的α3置换为小鼠的α3(A2/Db,A2/Kb),以匹配CD8分子。

第三代HLA转基因小鼠(HHDII)除了有A2/Db转基因，还用基因敲除的方法去除小鼠的MHC分子。

（二）TCR-HLA人源化小鼠

细胞免疫系统在抗病原和抗肿瘤免疫中起重要作用,小鼠细胞免疫系统基因人源化是非常重要的研究方向。

李亮平等在德国Max-Delbrueck分子医学中心(MDC)利用先进技术建立了非常复杂的人源化T细胞抗原识别系统小鼠：

通过构建人T细胞受体基因alpha和beta位点人工酵母染色体(Yeast artificial chromosome，YAC)转基因鼠，并与第三代HLA-A2(HLA,human leukoeyte antigen人类白细胞抗原)转基因鼠和Db/β2m基因敲除鼠(HHDII品系)交配，然后再与TCR-α/-β基因敲除鼠交配产生人源化T细胞抗原识别系统小鼠。

（一）TCR-MHC T细胞抗原识别系统：

主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)分子能与经过蛋白酶体或溶酶体处理的9～14氨基酸残基抗原肽结合，将抗原肽呈递到细胞表面，供T细胞识别；T细胞通过TCR识别MHC分子呈递的抗原肽。HLA为人类的抗原呈递分子,小鼠的MHC分子称为H2。

近十多年来,对TCR和MHC的分子结构与功能有深入的了解,有助于设计更好的TCR-HLA人源化小鼠。

（二）人类抗原呈递分子MHC的结构：

MHC分子有I类和II类。I类分子呈递CD8T细胞识别的抗原(9-11AA肽段),1I类分子呈递CD4T细胞识别的抗原(14AA肽段)。

MHCI类分子由非共价键连接的两条多肽链组成,其中重链由MHCI类基因编码；轻链为β2-微球蛋白(β2m),由B2M基因编码。

重链又称a链，为跨膜蛋白；a链可分为肽结合区和免疫球蛋白样区组成的胞膜外区,穿膜区以及胞质区。a链胞膜外区可细分为肽结合区(peptide-binding region)(α1和α2结构域),CD8分子结合区(α3)。

α1和α2结构域远离细胞膜位于分子的顶部,所组成的空间结构是与抗原结合部位和被T细胞受体(TCR)识别的部位。与抗原结合部位的构象呈深槽状，可容纳8～20个氨基酸残基,其大小和形状适合于已加工处理的抗原片段。

MHCI类抗原分子的多态性主要位于形成两侧面的a螺旋结构上,与I类抗原呈递抗原的功能相关；形成深槽内部氨基酸的侧链主要通过盐键、氢键与抗原多肽结合。位于深槽外部和表面氨基酸是TCR识别的部位。

MHCα3结构域和β2m蛋白靠近细胞膜,位于分子的底部。CD8分子与MHCI类分子α3结构域结合。TCR的亲和力相对于抗体而言是相当低的,CD8分子与α3结构域结合有助于T细胞识别抗原。

（三）TCR基因位点的结构：

TCRα基因位点(TRA)位于7号染色体,TCRβ基因位点(TRB)位于14号染色体。在胚系中.编码TCR链的DNA是由多个分隔开的基因片段组成；TRA有127个基因片段，而TRB有82-85个基因片段。

每一个TCR胚系基因包括可变区(V区),结合区(J区)和恒定区(C区)等基因片段，在TCRβ基因中还包含多样区(D区)。

在TCR基因位点的5'端包含不同数量的V区基因片段，可根据相似性将其分成多个亚家族。

TRAV基因又分为29个亚家族，而TCRβ基因所含24个亚家族；在TCR基因位点的3'端包含不同数量的(D)J基因片段和C基因片段。TRA含有61个」基因(50个有功能)；TRB有2个D基因和12个J基因。

此小鼠模型可用于产生人单克隆T细胞受体,可广泛用于肿瘤及病毒免疫治疗等重要领域的研发。

器材：PCR仪、培养基。

TCR人源化动物模型的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

小鼠的免疫系统与人类极为相似,但小鼠许多肿瘤抗原的蛋白质序列与人类不同，因此小鼠胸腺不会对与人体蛋白质非同源(non-homologous)序列产生耐受，而基因敲除鼠对整个敲除的蛋白质都不会产生耐受,因而为诱导和分离高活性肿瘤抗原特异性T细胞提供了条件。

我们用肿瘤抗原肽加CpG和IFA免疫TCR-HLA人源化小鼠，已成功地诱导肿瘤抗原免疫反应,分离到了肿瘤抗原如Melan-A和tyrosinase的特异性T淋巴细胞，然后制备其TCR的cDNA。

再将TCR cDNA序列克隆于逆转录病毒载体。实验证实这些TCR能识别肿瘤抗原。用这些TCR载体转染原代人T淋巴细胞，将这些细胞转变成了抗肿瘤的T淋巴细胞，可杀伤靶细胞。