谁做过人源MCSs成脂实验呀

1.从单层细胞中收集MSCs；

2.向6孔培养板的每个孔中加入2ml CCM，共有1&time105个细胞。最终密度约1&time103个细胞/cm2；

3.将上排3个孔标记为“成脂”，下排3个孔标记为“阴性”；

4.在37℃，5%CO2环境下孵育，每隔两天更换一次培养基，直到细胞达到7.%—80%汇合；

5.达到所需的细胞密度时，从孔中吸出完全样机，向6孔培养板上排的孔中加入2ml FDM，向下排的孔中加入2ml CCM；

6.在37℃，5%CO2环境下孵育，每隔两天更换一次培养基。ORO检测时，于21天对细胞进行染色；

（1）从培养箱中取出分化后的MSCs，每孔中的单层细胞用2ml A润洗两次；

（2）每孔中加入2ml福尔马林，室温固定单层细胞10min；

（3）吸出福尔马林，每孔中加入2ml A润洗两次后，再用2ml蒸馏水润洗一次；

（4）加入2ml ORO工作液，室温孵育30min；

（5）过量A润洗各孔，直到“阴性”孔中的背景染色最大限度地清除；

7.用显微镜观察标记为“成脂”的单层细胞评价脂滴的染色程度。成脂分化达到令人满意的水平时，单层细胞ORO着色面积超过30%。此时，单层细胞可在4℃ A中最多存放7天。或者，将ORO从着色的单层细胞中提取出来，用先前描述的方案进行测定。

获取成人脂肪组织，使用手术吸脂的方式获得目标脂肪组织。将使用吸脂手术取得的脂肪组织通过D-Hank’s把麻醉药和血细胞洗涤干净。洗涤后用0.075%的I型胶原酶37摄氏度消化一小时。将未消化组织使用100目筛网过滤掉。室温、1400转/min、离心十分钟，将上清去除。再次使用D-Hank’s重悬洗涤2次(室温、1200转/min、离心七分钟)，将胶原酶去除掉。离心收集细胞。