临床样本DNA模板的常规制备方法

一、 病毒标本中提取DNA(支原体、腺病毒)处理方法

（1）将擦拭过的咽拭纸放入1.5ml装有1ml生理盐水的eppendorf管中。

（2）以10,000r/min离心5分钟，去上清液。

（3）沉淀物加入30 ml TE液混匀后煮沸10分钟，4℃保存备用。

二、 从细菌中提取DNA

1．NG（淋球菌）DNA的提取

标本可取自尿道、生殖道或结膜分泌物。

（1）取男性尿道口或女性宫颈处分泌物于事先加有1ml生理盐水的eppendorf管内。

（2）振荡棉签或拭纸使NG释放出来。

（8）加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。

（9）去乙醇，空气干燥后加入30μl的TE液，置4℃冰箱保存备用。

2．TB（结核杆菌）DNA的提取

临床标本可来源于痰、尿、支气管灌洗液、胸水、腹水、心包积液等。处理方法也不尽相同，除痰标本外，其他标本大致相同。注意痰标本的留取一定要取次日早上的晨痰，留存器皿要无菌消毒，避免污染。

（1）痰标本TB DNA的提取

①挑少许痰液放入1.5ml的eppendorf管中，加入5mo1/L NaOH 500μl混匀，使痰液变稀，室温中摇动20分钟。

②加入1mo1/L NaH2 PO4 600μl混匀（起中和作用），10,000r/min离心5分钟。

③去上清液，补加TE至500μl混匀，加少许溶菌酶。

④置37℃消化30分钟。

⑤加等体积的酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）混合液，摇匀20分钟。

⑥10,000r/min离心5分钟，将上清液移至另一干净eppendorf管中，加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液，继续摇匀20分钟。

⑦10,000r/min离心5分钟，移上清液于另一小管中，加入等体积异丙醇摇匀。

⑧10,000r/min离心5分钟，去上清液，置空气中干燥，加入30μlTE溶解沉淀物，置4℃冰箱备用。

（2）胸水、腹水、支气管灌洗液、尿液、心包积液标本TB DNA的提取

①将上述液体3ml，经反复离心，去上清液，留沉淀物。

②按上述痰标本处理操作步骤③-⑧提取。

三、组织内基因DNA的提取

1．HPV（尖锐湿疣）提取

（1）取绿豆大小的组织样品于1.5ml的eppendorf管中，加入细胞裂解液少许，裂解液含0.1mo1/L NaC1、0.2mol/L蔗糖、0.01 mol/L EDTA、0.3mol/L tris（pH8.0）和0.5%-1% SDS。

（2）用眼科剪剪碎组织（越细越好），补足裂解液至400μl，并搅散组织块。

（3）置60℃―65℃水浴消化2-3小时，中间摇匀两次。

（4）加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液抽提，摇匀20分钟。

（5）10,000r/min离心5分钟，上清液移入新的eppendorf管中，用两倍体积的乙醇沉淀DNA。

（6）10,000r/min离心5分钟，去上清液，空气干燥沉淀物，加入30μl的TE，置4℃保存备用。

2．各种肿瘤组织提取（胃、肠、心肌、骨骼肌、肝、腺癌、子宫、绒毛等）

（1）取绿豆大小的组织样品于1.5ml的eppendorf管中，加入细胞裂解液少许，每10ml裂解液含有：

1 mol/L Tris-HCl 0.1ml

0.5mol/L EDTA 2ml

5 mol/L NaC1 0.2ml

20% SDS 1ml

200 μg/μl蛋白酶K 1ml

1 mol/L DTT 0.39ml

（2）用眼科剪尽量剪细组织块，补加细胞裂解液至500μl。

（3）55℃~66℃保温2~3小时，中间摇匀两次。

（4）加入等休积的酚、氯仿、异戊醇混合液摇匀20分钟，10,000r/min离心5分钟。

（5）上清液移入新的eppendorf管中，加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液继续摇匀20分钟，10,000r/min 离心5分钟。

（6）上清液移入新的eppendorf管中，加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。

（7）挑出DNA，用70%乙醇洗两次，空气干燥，加适量TE溶解DNA（根据DNA量决定加入TE量），置4℃保存备用。

四、血标本DNA的提取

方法一：

（1）取抗凝外周血50μl，加入6mol/L，NaI 50μl，混匀，振荡30秒。

（2）加等体积的氯仿、异戊醇混合液，振荡30秒。

（3）10,000~12,000r/min离心2~5分钟。

（4）取上清液移至新的eppendorf管中，加入异丙醇80μl混匀，至沉淀产生。

（5）12,000r/min离心3分钟，去掉异丙醇，37%异丙醇再洗一次，离心，去上清液，沉淀物干燥后（放室温），加入30μl无菌水溶解，置4℃保存备用。

方法二：

（1）取10ml外周血，放于50ml管中，按1.3:10加入ACD抗凝。

（2）4,000r/min离心10分钟，去上清液。

（3）加1.7%NH4 Cl至50ml，混匀，放37℃保温45分钟。

（4）4,000r/min离心10分钟，去上清液。

（5）加入50ml PBS液混匀，4,000r/min离心10分钟。

（6）去上清液，沉淀物中补加TE液至10ml，充分混匀。

（7）加入2.5ml 5mol/L NaClO4 ,混匀，加3ml 10%的SDS混匀。

（8）置55℃~60℃保温2~3小时。

（9）加入等体积的酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）混合液摇匀40分钟。

（10）4,000r/min离心10分钟，轻轻将上清液移入新的eppendorf管中。

（11）用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，轻摇，挑出悬浮DNA放入新管中。

（12）加入5 ml的TE液，溶解后加50μl RNA酶(20mg/ml)。

（13）置37℃温箱中保温1小时，加50μl 10%SDS、100μl 20mg/ml的蛋白酶K、120μl 0.5mol/L的EDTA混匀，37℃过夜。

（14）加5ml TE液，混匀后加10ml 酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）混合液，混匀，放置40分钟。

（15） 4,000r/min离心10分钟，去上清液，加入2倍体积的无水乙醇，沉淀DNA，挑出DNA用75%乙醇洗两次。

（16）空气干燥后，加入适量TE溶解DNA，置4℃备用。