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细胞自噬的研究方法介绍

嘉美纽诺生物

10251

正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,经报道的工具药有:

一、自噬诱导剂

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激

(2) Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)

(3) Earle's平衡盐溶液:制造饥饿

(4) N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制剂

(5) Rapamycin:mTOR抑制剂

(6) Xestospongin B/C:IP3R阻滞剂

二、自噬抑制剂

(1) 3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制剂

(2) Bafilomycin A1:质子泵抑制剂

(3) Hydroxychloroquine(羟氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶体腔碱化剂)

除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义 RNA 干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。

三、自噬过程进行观察和检测

细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。

自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。(autophagic vacuole,AV)

2、在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成,人们利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用 Western Blot 检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成

自噬形成时,胞浆型 LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。
(注意:LC3 抗体对 LC3-II 有更高的亲和力,会造成假阳性。方法 2 和 3 需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、检测长寿蛋白的批量降解:非特异

5、MDC(Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。

6、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。

四、自噬相关蛋白的定位

在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位:

Lamp-2:溶酶体膜蛋白,可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针:有红或蓝色可选,显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito:载体,转染后表达一个融合蛋白(红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号),可用来检测线粒体被自噬掉的程度(Mitophagy)。

MitoTraker 探针:特异性显示活的线粒体,荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60:定位与线粒体基质,细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin(钙网织蛋白):内质网腔

(注意:这些蛋白均为胞浆蛋白,爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜(permeablize),可采用 0.1%SDS 处理。)

实验案例 原代XXXX上皮细胞干预培养及MTT细胞增殖毒性检测

实验样本:原代XXXX上皮细胞

实验药物:A药物

刺激浓度:0.1%,0.01%,0.001%,0.000l%

时间点: 30 min、2 h、6 h、24 h

实验方案:常规细胞传代,用第 2~4 代细胞。传代后孵育至少 24 h 至细胞 70% 融合:细胞移入 96 孔板内,5×103 细胞/孔, 待细胞贴壁后,移去原培养液,加入含 0.1%,0.01%,0.001% ,0.000l% 共 4 个浓度的 A 药物培养液。

在 30 min、2 h、6 h、24 h 共 4 个时间点时实验终止,每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20uL,继续孵育 4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,每孔加 DMSO(Dimethyl sulfoxide)150 uL,室温下振荡 10 min,立刻在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值 (选择波长 490 nm)。

每浓度每时间点做 5 孔。设空白对照 1 孔 (不加细胞只加培养液), 最后比色以对照孔调零。实验试剂:MTT(sigma)

操作步骤:在 96 孔板加入细胞 100μL/孔(约 5×103),置 37℃ 5%CO2 细胞培养箱培养 24 小时;

待细胞贴壁后,移去原培养液,加入含 0.1%,0.01%,0.001% ,0.000 l% 共 4 个浓度 A 药物培养液;

在 30 min、2 h、6 h、24 h 共 4 个时间点时实验终止;每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 溶液 20ul,继续孵育 4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液;每孔加 DMSO(Dimethyl sulfoxide)150 uL,室温下振荡 10 min,立刻在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度值 (选择波长 490 nm)。

实验分组:

A 正常培养组

B 0.0001% A 药物培养液
C 0.001% A 药物培养液
D 0.01% A 药物培养液
E 0.1% A 药物培养液

结果分析:细胞存活率% =(加药细胞 OD -本地 OD /对照细胞 OD-本地 OD)×100%

注:本底 OD 值(完全培养基加 MTT,无细胞)

30 min 时,490 nm 波长各孔的 OD 值

分组 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 平均值
A 0.487 0.481 0.466 0.473 0.459 0.4732
B 0.465 0.453 0.441 0.437 0.432 0.4456 94.1%
C 0.421 0.416 0.414 0.408 0.435 0.4188 88.3%
D 0.406 0.395 0.388 0.384 0.393 0.3932 82.8%
E 0.388 0.373 0.369 0.377 0.382 0.3778 79.5%
本底 0.007 0.009 0.012 0.008 0.008 0.0088


2h时,490 nm波长各孔的OD值

分组 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 平均值
A 0.507 0.524 0.511 0.505 0.496 0.5086
B 0.488 0.479 0.463 0.466 0.470 0.4732 92.9%
C 0.453 0.449 0.466 0.451 0.447 0.4532 88.9%
D 0.428 0.434 0.437 0.419 0.422 0.428 83.9%
E 0.407 0.386 0.393 0.406 0.399 0.3982 78.0%
本底 0.006 0.009 0.007 0.007 0.008 0.0074

6h时,490 nm波长各孔的OD值

分组 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 平均值
A 0.569 0.570 0.562 0.557 0.568 0.5652
B 0.547 0.552 0.541 0.536 0.544 0.544 96.2%
C 0.523 0.515 0.511 0.508 0.512 0.5138 90.8%
D 0.475 0.461 0.476 0.455 0.448 0.463 81.7%
E 0.427 0.421 0.418 0.422 0.404 0.4184 73.7%
本底 0.008 0.009 0.007 0.007 0.009 0.008


24h时,490 nm波长各孔的OD值

分组 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5 平均值
A 0.655 0.647 0.658 0.649 0.662 0.6542
B 0.623 0.619 0.615 0.634 0.622 0.6226 95.1%
C 0.604 0.575 0.591 0.587 0.582 0.5878 89.7%
D 0.503 0.526 0.522 0.518 0.515 0.5168 78.7%
E 0.437 0.448 0.421 0.446 0.438 0.438 66.5%
本底 0.008 0.009 0.009 0.011 0.008 0.009


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