细胞自噬的研究方法
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一、自噬诱导剂
(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激
(2) Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)
(3) Earle's平衡盐溶液:制造饥饿
(4) N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制剂
(5) Rapamycin:mTOR抑制剂
二、自噬抑制剂
(1) 3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制剂
(2) Bafilomycin A1:质子泵抑制剂
除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义RNA干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。
三、自噬过程进行观察和检测
细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:1、观察自噬体的形成
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成
3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成
四、自噬相关蛋白的定位
在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位:Lamp-2:溶酶体膜蛋白,可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针:有红或蓝色可选,显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito:载体,转染后表达一个融合蛋白(红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号),可用来检测线粒体被自噬掉的程度(Mitophagy)。
MitoTraker探针:特异性显示活的线粒体,荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60:定位与线粒体基质,细胞死亡时不会被释放。