细胞自噬的研究方法：我是为了保护自己

自噬的过程——从一张图开始

步骤 1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似「脂质体」样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由 2 层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为 Phagophore，是自噬发生的铁证之一。

步骤 2： Phagophore 不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入「碗」中，然后「收口」，成为密闭的球状的「自噬体」，即 autophagosome。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有 2 个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。

步骤 3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个「可」字，意思是这种情况不是必然要发生的）。

步骤 4：自噬体与溶酶体融合形成 autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，二者的内容物合为一体，自噬体中的「货物」也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

1. 自噬诱导剂

Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即 Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

Earle's 平衡盐溶液：制造饥饿

N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制剂

Rapamycin：mTOR 抑制剂

Xestospongin B/C：IP3R 阻滞剂

2. 自噬抑制剂

3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂

Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）

除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义 RNA 干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

自噬的观察与检测

细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

1. 观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。

自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。

自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

2. 在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3. 利用 Western Blot 检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成

自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即 LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。

LC3 抗体对 LC3-II 有更高的亲和力，会造成假阳性。方法 2 和 3 需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。

4. MDC 染色

MDC 染色即 Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺染色，包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

5. CellTrackerTM Green 染色

主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

自噬相关蛋白定位

在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker 探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔。

Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用 0.1% SDS 处理。

参考文献：

Methods for Assessing Autophagy and Autophagic Cell Death

Cytosolic LC3 Ratio as a Sensitive Index of Macroautophagy in Isolated Rat Hepatocytes and H4-II-E Cells