传代培养细胞染色体显示法

1.培养细胞：取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80%~90%汇合单层培养细胞。

2.加秋水仙素：使用最终浓度为0.02~0.8微克/毫升营养液，温箱继续培养6~10小时；或用低温封闭法：把培养细胞置于4℃条件下6~12小时后，再于37℃温箱继续培养6~10小时处理（加秋水仙素）。

3.采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90%的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。

4.离心：收集培养液，1000转/分钟离心5~10分钟。

5.低渗处理：吸除上清液、加入预温至37℃的0.075M KCl溶液，在温箱中静置20~30分钟。

6.预固定：向悬液中加新鲜1:3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。

7.固定：离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5~10ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15~20分钟。

8.重复7，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5~1ml。

9.制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2~3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。

滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。

10. 染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。