单抗制备克隆筛选及克隆化

互联网2013-11-19

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一个脾脏中，能分泌抗体的细胞占的比例很少，90%以上的细胞是不能分泌抗体的。即使进行了人工免疫，能分泌出针对人工免疫的抗原的抗体的细胞占能分泌抗体的细胞的比例也是很低的。

因此，尽管一个成功免疫的脾脏可达到2×108个细胞以上，但进行了细胞融合后能得到目标杂交瘤的数量也是很有限的，如何筛选出这些能分泌目的抗体的杂交瘤是一个非常关键的问题。

一般来说，制备单抗的目的决定了筛选克隆所用的方法。但是实际制备过程中，融合后得到的克隆非常多（一般在500个-2000个克隆），而细胞在形成克隆后，在同一个培养孔中培养的时间不能太长，否则容易长满，因此初步筛选应该选择一个非常快速的方法。目前主要有这么几种方法：

（1）间接血凝实验（IHA）。即将抗原偶联到红细胞上，然后加入待检测的细胞上清，上清中如果有能识别抗原的抗体，那么红细胞将会聚集。这种方法不需要太多的设备，但是操作比较麻烦。

（2）免疫荧光（IF）或免疫细胞化学（ICC）或免疫组织化学（IHC）。这三种方法的原理比较类似，都是将能天然表达出抗原的细胞或组织固定，再加入待检测的细胞上清，然后加入二抗，最后显色，这种方法可以通过定位是否正确来判断细胞上清中是否有正确抗体。

（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）。

由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此ELISA是最适合用于初步筛选的方法。关于ELISA的原理讲解，在本站的其它页面将有详细的介绍，这里就简单地讲一下间接ELISA用于筛选克隆的主要步骤。

（1）包被。将抗原以pH 9.6的NaCO3-NaHCO3包被，每块酶标板以5-20 ug抗原为宜（如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加大包被量）。每孔的包被体积为50-100 ul。37 ℃包被2 h或4 ℃包被过夜。

（2）封闭。倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，以0.5-1% BSA（用PBST溶解）或5% 脱脂牛奶（PBST溶解）或1% 明胶（PBST溶解）于37 ℃封闭2 h或4 ℃封闭过夜，也可以使用10%小牛血清或其它无关物种血清封闭。封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于4 ℃密封保存以备后面使用。

（3）一抗。封闭完后，弃去孔内液体，拍干，加入待检测细胞上清，每孔100 ul为宜。在每块板子上做好记号。37 ℃孵育1 h。

（4）二抗。孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以PBST洗涤3次，每次5min。根据二抗说明稀释好二抗，每孔加入100 ul.37 ℃孵育1 h。

（5）显色。孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂。待颜色最深时用终止液终止反应。用酶标仪读出各孔OD值，选择出阳性孔。

如果所用的抗原比较珍贵，而且量又少，可以做两次ELISA。第一次将细胞上清直接包被在酶标板上，无需封闭，加入二抗，洗涤后显色，可以筛选出可以分泌抗体的细胞株，再从这些可以分泌抗体的细胞株内做第二次ELISA，这一次用上面讲到的方法进行，这样可以减少抗原用量。

经过ELISA筛选出的阳性克隆即可进行克隆化，或者在允许的情况下继续培养作其它的鉴定实验（如WB，IHC，IF等实验）。一般建议先进行克隆化，因为如果不进行克隆化，当阳性孔有非抗体分泌型的杂交瘤时，非抗体分泌型的杂交瘤由于生长速度更快，将会占主导生长，最终很难分离出目标杂交瘤以至丢失。

融合后的细胞在孔里生长时，一般并不是一个单纯的克隆（一般是两个或者多个克隆，就算肉眼看到的是形成一个完整的克隆，但事实上可能是由两个或者多个原始的杂交瘤形成的），如果直接将其扩大培养将会产生两个问题：一是如果有两个或两个以上的克隆或一个克隆实际上是由两个克隆长在一起形成的。

并且都分泌抗体，那么就有可能产生针对不同表位的抗体，这样最终得到的抗体不是单克隆抗体，而是“二克隆抗体”或“多个克隆产的抗体”；另一个问题是如果克隆中包括不能分泌抗体的杂交瘤，那么不能分泌抗体的杂交瘤因为增殖速度更快，最终将成为优势生长细胞。

导致目标杂交瘤无法分离甚至完全消失。所以，细胞融合后，一旦鉴定可以产生目标抗体，就应立即进行克隆化，确保能分离出单个细胞重新形成克隆。

杂交瘤克隆化一般有这么几种方法：（1）有限稀释法；（2）半固体培养法；（3）显微操作法；（4）荧光激活细胞分离法（FACS）。实际操作中，为了非常肯定得到的克隆由单个杂交瘤发展形成，一般至少要经过两至三次克隆化。下面就上述几种克隆化方法进行简单介绍。

有限稀释法有限稀释法是最简单的克隆化方法，这种方法不需要太多的仪器设备，操作也不复杂，因此应用最广泛。

其原理是，将培养孔内细胞用枪或吸管吹打使之悬浮，然后用计数板进行计数，最后按每孔0.5-1个细胞的量将原孔细胞稀释滴至新的培养板上（事先制备好饲养层细胞），培养一段时间以后就可以看到部分孔有单个克隆形成（理论上讲最终每孔的细胞个数在整体上服从泊松分布）。

实际操作中经常会遇到这样的问题：由于计数不准确或者移液器的偏差，最终导致操作结果不理想，例如大部份孔内都不止一个克隆长出或者基本上无克隆生长。另外，由于细胞经过吹打的剪切力破坏，细胞也不一定能够按期望生长。但是这些问题都是可以克服的。

式中λ在有限稀释里的意义是稀释时设计的每孔细胞的平均数,k则代表可能出现的细胞个数。目前已经有现成的泊松分布表可以直接查阅，不用复杂的计算了（点击这里查看泊松分布表）。

举个例子，假如做有限稀释时，按平均每孔0.5个细胞（即λ=0.5）的浓度稀释好细胞滴入96孔板，那么最理想的情况从泊松分布表上查出来就是：60.65%的孔内不会出现细胞生长，30.33%的孔内有一个细胞形成克隆。

7.58%的孔内会有两个细胞形成克隆，1.26%的孔内会有三个细胞形成克隆，0.16%的孔内会有四个细胞形成克隆，0.02%的孔内会有五个细胞形成克隆，基本上不会出现由6个或6个以上的细胞形成的克隆的孔。

有了这个公式作指导，实际操作中对稀释的调整就有依据了，如果在进行有限稀释操作中存在计数、取样偏差等因素影响结果，就可以多次尝试，确定修正公式中的a值，为以后的实验提供一个比较稳定的经验λ值，使稀释过程更加理想（即尽可能多地出现一孔只有一个克隆生长）。

半固体培养半固体培养原理和做分子克隆时的菌落筛选有点类似，其方法是将杂交瘤细胞与液体低融点的琼脂糖或甲基化纤维素溶液混合，然后将其倒入含有事先制备的饲养层的培养板上，冷后后培养基呈固态。

在37℃培养一段时间后，单个杂交瘤细胞会形成类似菌落的小克隆，可以用枪头将其挑出到培养板上在液体培养基里培养，这样也可以实现克隆化。这种方法操作比较直观简单，只是半固体培养基的要求比较高，容易出现细胞不生长或者污染情况发生。

显微操作法这种方法可谓是最初级、最直观、最省脑力和人力的办法，步骤很简单，把阳性孔里的细胞稀释到足够稀，静置半小时后细胞会沉淀到孔底，然后在显微镜下用枪直接吸取一个单细胞转移到含有饲养层细胞的孔内培养即可。

荧光激活细胞分离法很多文献上都用这个名字，其实它就是流式细胞技术的一种，其原理是在能分泌抗体的孔内加入荧光二抗，荧光二抗就可以与杂交瘤细胞表面结合。

将细胞逐个通过荧光激活细胞分离器时，细胞表面的二抗荧光就被激发，计算机系统可以检测到此荧光，并根据荧光强度与细胞大小区别，可以将细胞分级收集，最终实现克隆化。很明显，这种方法操作精准，但是技术和设备要求都很高，不适合一般的中小型实验室使用。

前面说过，一般杂交瘤都需要经过两至三次克隆化才能保证其纯度和克隆的稳定性，不主张图方便而只进行一步克隆化操作（显微操作和FACS可只进行一至两次）。确保克隆稳定和纯度后，便可以扩大培养克隆而收集细胞上清或者腹水中的抗体了。