单抗制备细节

summerray：请教如题，在脾细胞与瘤细胞融合时的一些问题

1 半分钟内加入PEG后静止一分钟前需不需要稍微吹匀呢，此时有不均匀细胞团块。

2 加入不完全培养液中止聚合后，需不需要先吹匀再离心呢，此时细胞团块在底部。

3 如何避免每个孔内是单个克隆呢，往往有好几个。

4 有限稀释法克隆化时有没有不计数的方法呢，肯定是有（很久以前一个老师那样做过，很难联系），如何操作呢。

多谢！

丁香园网友yuinsea认为：

1.加PEG时边加边轻轻搅拌

2.终止后，不要吹打，防止聚合的细胞又分开

3.融合后多分到几块板里，便于筛选

4.计数不麻烦，不要偷懒～

丁香园网友summerray认为：

还有要问的，不知道放假时候有没有解答！

4.克隆化检测时若是交叉筛选，ELISA 每孔100微升，孔里的上清不够200微升怎么办？还是每孔50微升就可以？

5.每次克隆化都要做交叉筛选吗？

6.克隆化一个克隆长起来的孔大部分为阳性时，是不是取一个od值高的再次克隆化就可以？

盼解答！

丁香园网友stephen秋认为：

4。50μl太少，会影响结果。你包被的抗原和你的一抗二抗量必须一致。

5，最好做交叉，因为刚开始单克隆时候会不纯。

6，你只取一个会不会太少？最好同时多取几个，以免丢失或者污染什么的。

丁香园网友summerray认为：

4。我向孔里再留一点液体，一面补液时将克隆吹开；ELISA时，若加70微升，在加30微升封闭液，可好？

丁香园网友yuinsea认为：

4.克隆化检测时若是交叉筛选，ELISA 每孔100微升，孔里的上清不够200微升怎么办？还是每孔50微升就可以？

5.每次克隆化都要做交叉筛选吗？

6.克隆化一个克隆长起来的孔大部分为阳性时，是不是取一个od值高的再次克隆化就可以？

4.只要你的克隆足够大，做ELISA时可以每孔加50μl上清的，50μl可以铺满孔底的。不要为了达到100μl的量再去进行稀释。

5.应该每次都做交叉筛选，确定你的阳性克隆，防止做无谓的其它工作。

6.克隆孔大部分细胞为阳性是不够的，一定要孔里细胞克隆化后阳性率达100%，因为不分泌抗体的细胞生长更快，会在持续的培养中挤走分泌抗体的细胞！你可以多取几个od值高的克隆克隆化，以防万一。

丁香园网友summerray认为：

7.克隆化后的细胞直接从96孔转到24孔吗？

8.克隆化时计数按1个细胞/孔加入，为什么有一般的孔长不出克隆呢，而有的孔会长2个，开始以为没有吹匀，结果吹时注意了还是这样，不知为什么。

丁香园网友yuinsea认为：

7.克隆化后的细胞直接从96孔转到24孔吗？

8.克隆化时计数按1个细胞/孔加入，为什么有一般的孔长不出克隆呢，而有的孔会长2个，开始以为没有吹匀，结果吹时注意了还是这样，不知为什么。

7.克隆化后的细胞直接从96孔转到24孔进行扩大培养。

8.克隆化时，计数后稀释培养和预期结果不完全一样是很正常的，在统计上是存在一个正态分布的，不用担心。为了防止计数的不准确，可以多做几个稀释度，以防万一。