嵌合抗CD20 Fab诱导Raji细胞凋亡

【摘要】为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制，本研究利用3H掺入法测定嵌合抗CD20 Fab对Raji细胞生长的影响，结果显示嵌合抗CD20 Fab对Raji细胞的生长具有抑制作用；利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20 Fab诱导Raji细胞凋亡作用，结果显示嵌合抗CD20 Fab可诱导Raji细胞凋亡作用。

这些实验结果证明嵌合抗CD20 Fab通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。

【关键词】B淋巴细胞瘤嵌合FabCD20 凋亡

【前言】CD20是B淋巴细胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，CD20对B细胞的分化增殖具有调节作用[1]，CD20仅表达于B淋巴细胞表面，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞均不表达，CD20从前-B淋巴细胞阶段开始表达，直到浆细胞阶段才无CD20表达[2-4]。CD20比较暴露不为其它表面分子所掩盖，因而容易接近。

CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少。在人体血清中无游离的CD20存在[5]。最重要的是所有B淋巴细胞瘤超过95%都有CD20的表达且没有显著内吞和脱落[6]。以CD20作为治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点具有很好的选择性。

HI47（IgG3）是我所于1990年研制成功的国内第一个抗CD20鼠源性单克隆抗体，第四届国际人类白细胞分化抗原会议将HI47命名为CD20+X[7]。我们利用噬菌体显示技术克隆到HI47可变区基因，利用该基因构建了嵌合抗CD20 Fab片段，并在大肠杆菌中可溶性分泌表达[8]，本研究旨在研究抗CD20 Fab抗肿瘤活性的机制。

一、材料与方法

1、材料

PI为Sigma公司产品；3H-UdR购于中国原子能研究所；Raji细胞为我室所存，用含小牛血清10%的RPMI1640培养基培养；嵌合抗CD20 Fab表达载体pYZFcd20由我室构建；大肠杆菌16C9为我室所存；Rituxan购于罗氏公司。

2、方法

（1）嵌合抗CD20 Fab表达及分离纯化

嵌合抗CD20 Fab表达及分离纯化如以前所述[8]，简单说，挑取单菌落pYZFcd20转化的16C9菌株接种5ml含氨苄青霉素50g/ml的2×YT培养基，37℃，200rpm，振荡培养6小时；离心收集菌株，将菌株重新悬浮于20ml含氨苄青霉素50g/ml的AP5培养基，诱导表达培养24小时；

离心收集菌体，将菌体于-20℃冻存1小时，化冻后加1ml细菌周质腔蛋白提取液，振荡混匀，置于4℃轻摇1小时，22，000×g，4℃离心20分钟，取上清，用protein G Agarose亲和柱分离纯化嵌合抗CD20 Fab。

（2） Fab对3H掺入Raji细胞的影响

按1105细胞/孔接种96孔培养板，加入Fab溶液至终浓度为50g/ml，每个样品做三个平行孔，以抗CD20抗体Rituxan和HI47为阳性对照，以PBS为阴性对照，37℃，5%CO2培养24小时，每孔加入3H –UdR 0.5Ci，继续培养18小时，收集细胞，闪烁仪记数。

（3） Fab诱导Raji细胞凋亡实验

按1106细胞/孔接种24孔培养板，加入Fab溶液终浓度为50g/ml， 以PBS为空白对照，37℃，5%CO2培养24小时，2600g离心10分钟，收集细胞，PBS洗2次，加70%的乙醇混匀，4℃，固定一小时，2600g离心10分钟，弃上清，PBS洗2次，加20l PI室温避光放置15分钟，FACS测定。

二、结果与讨论

1、嵌合抗CD20 Fab对Raji 细胞生长的影响

人体对鼠源性抗体的免疫反应（HAMA）以及抗体的产量是限制单克隆抗体在肿瘤临床治疗中应用的两个主要障碍，人源抗体的制备以及抗体的人源化可大大降低抗体的免疫原性，嵌合抗体是由鼠源性抗体的可变区和人源性抗体恒定区组成的一种抗体。

这种抗体由于利用人源抗体的恒定区取代了免疫原性极强的鼠源性抗体恒定区，因而其抗原性大为降低，嵌合抗体既降低了鼠源性抗体的免疫原性又可以利用基因工程的方法构建并进行大量的生产，嵌合抗体不愧为抗体治疗剂的一种非常有效的形式。

CD20对B淋巴细胞的生长及分化具有调节作用，不同的抗CD20抗体，由于结合的抗原表位不同，可引起不同的生物效应，有的可激活B淋巴细胞，如IF5[9]；有的对B淋巴细胞的生长具有抑制作用。我们成功克隆到抗CD20单克隆抗体HI47轻重链可变区基因，构建并高表达了嵌合抗CD20 Fab。

与完整的抗体相比，Fab无Fc段，因此无抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）以及补体依赖的细胞毒作用（CDCC），但Fab分子较小，具有较高的肿瘤穿透力，在肿瘤的治疗中具有很重要的作用。

在本研究中，我们利用3H掺入法测定嵌合抗CD20 Fab对Raji 细胞生长的影响，结果在浓度为50g /ml时，嵌合抗CD20 Fab对Raji 细胞生长具有较明显的抑制作用，与Rituxan具有相似抑制活性。

嵌合抗CD20Fab特异性结合CD20，引起CD20构象发生变化，使得CD20功能的发生改变，从而引起了B淋巴细胞生长受到影响，这种抑制作用是嵌合抗CD20Fab特异性作用。

2、嵌合抗CD20 Fab诱导Raji细胞凋亡实验

抗CD20抗体主要是通过抗体介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDCC）以及诱导B淋巴细胞瘤的细胞的凋亡等机制发挥抗肿瘤的效果。

抗CD20抗体B1和IF5单独应用时并不诱导B淋巴细胞瘤的细胞的凋亡，但当用抗鼠IgG抗体将它们交联时，B1和IF5可诱导B淋巴瘤细胞凋亡[10]，而嵌合抗CD20抗体Rituxan单独应用时能诱导B淋巴瘤细胞凋亡[11]。

Fab由于没有Fc段，因而无ADCC和CDCC效应，3H掺入法测定结果显示嵌合抗CD20 Fab片段对Raji细胞的生长具有明显的抑制作用，为了研究嵌合抗CD20 Fab片段抑制Raji细胞生长的机制，我们以Rituxan为阳性对照，以PBS为阴性对照。

利用FACS测定嵌合抗CD20抗体Fab片段诱导Raji细胞凋亡的活性，在阴性对照中，Raji细胞凋亡率为3.6%，在阳性对照中，Rituxan可使7.6%的Raji细胞发生凋亡，嵌合抗CD20抗体Fab诱导Raji细胞凋亡的凋亡率为11.4%，其诱导活性几乎是Rituxan的两倍。

综上结果，我们的实验表明，嵌合抗CD20 Fab对Raji细胞的生长具有明显的抑制作用，其抑制作用主要是通过诱导Raji细胞凋亡的机制来实现，嵌合抗CD20 Fab有望应用于B淋巴细胞瘤的临床治疗。

【参考文献】

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