抑制B淋巴细胞瘤生长的嵌合抗CD20基因工程抗体
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【摘要】
目的 构建抗CD20嵌合抗体Fab'和F（ab）2片段表达载体，并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达，比较二者的活性差异。
方法 从相应的杂交瘤中提取mRNA建立抗CD20 ScFv 噬菌体显示文库，利用PCR方法从阳性克隆扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（VL）、重链可变区基因（VH），重组到表达载体pYZF1，构建抗CD20 Fab’和抗CD20 F（ab）2达载体pYZF1cd20和pYZcpp3，并在16c9菌中高效表达。MTT法测定Fab’和F（ab）2对Raji和Daudi细胞的生长抑制，利用裸鼠肿瘤模型测定二者的体内抑瘤活性。
结果 pYZF1cd20和pYZcpp3的表达产物，经分离纯化获得具有CD20特异结合活性的Fab’和F（ab）2片段。体外活性实验证明Fab’和F（ab）2可以特异性的与CD20+B淋巴瘤细胞结合，能竞争性抑制HI47与CD20分子的结合，F（ab）2竞争性结合CD20分子的强度大于Fab’；均能抑制B淋巴细胞瘤增殖，而且F（ab）2抑制B淋巴细胞瘤增殖的能力高于Fab’，F（ab）2对Raji和Daud细胞的IC50（22.8μg/ml、14.6μg/ml）低于Fab’对Raji、Daudi的IC50（45.9μg/ml、39.5μg/ml）。Fab'（50mg/kg，i.v.）和F（ab’）2(50mg/kg，i.p.）对荷瘤鼠瘤块体积的增长有抑制作用。
结论 实现了直接在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD20嵌合抗体Fab’和F（ab’）2的目的。Fab’适于显象，F（ab）2片段的抑制肿瘤生长活性明显高于Fab’，半衰期长于Fab’，更适于治疗。
【关键词】B淋巴细胞瘤嵌合抗体Fab’片段 嵌合抗体F（ab）2片段CD20
B淋巴细胞表面的膜蛋白CD20对B淋巴细胞的增殖和分化具有调节作用[1]。由于CD20分子仅在前-B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞中表达，而在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织均无CD20的表达[2，3，4]，在人体血清中亦无游离CD20的存在[5]，因此CD20可作为B淋巴细胞瘤治疗的一个理想治疗靶点。限制抗体临床使用的因素主要有抗体产生的免疫原性和抗体的生产能力是否能够满足临床需要。
第四届国际人类白细胞分化抗原会议将鼠源性单克隆抗CD20抗体HI47（IgG3）正式命名为CD20+X[6] 。本研究目的在于利用基因工程方法将鼠源性单克隆抗CD20抗体HI47可变区和人源抗体恒定区连接起来，构建嵌合抗CD20抗体Fab′和F（ab）′2片段，以降低鼠源性抗体的免疫源性。
我们构建了人源化的抗CD20抗体Fab′和F（ab）′2片段的载体，可在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达，并比较了二者的体外活性，结果均证实了Fab′和F（ab）′2片段具有抑制B淋巴肿瘤细胞生长的活性，这无疑为B淋巴瘤的临床治疗提供了有利的工具。
一、实验材料与方法
1、细胞与蛋白
人B淋巴瘤细胞系Raji与Daudi细胞由本室保存，用含有10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基于5% CO2，37C条件下培养。抗CD20单克隆抗体HI47由我所免疫室提供。辣根过氧化酶标记羊抗人IgG，FITC标记的羊抗鼠IgG购于北京中山生物工程公司。
2、抗CD20单克隆抗体轻、重链基因的克隆
利用RT-PCR法，采用抗体通用的兼并性引物，从HI47杂交瘤细胞特异性地分别扩增抗体轻链、重链可变区基因（VL和VH）后，利用编码短肽（G4S）3的连接链DNA片段，经overlap PCR，将VH和VL基因连接构成ScFv基因（约750bp），在PCR扩增ScFv基因的过程中，在ScFv基因片段5端、3端分别引入SfiI和NotI酶切位点，ScFv基因PCR扩增产物经SfiI和NotI酶切后，重组到pCANTAB 5E载体相应的酶切位点中，构建噬菌粒表达载体pCANTAB5Ecd20scFv。
3、抗CD20 ScFv 噬菌体显示文库建立、筛选及鉴定
采用电穿孔方法将pCANTAB5Ecd20scFv质粒转入TG1细菌中，接种2YTAG培养基，37℃，200rpm摇床培养至OD600为0.8，加入M13K07辅助噬菌体（4109 pfu/ml培养液），继续培养1小时后，4000rpm，离心10分钟，弃上清，将菌株悬浮于适当体积的2YTAK培养基，30℃培养过夜，提取噬菌体。
将提取的噬菌体与已用10%胎牛血清的PBS（pH 7.4）封闭1小时的Daudi细胞（107个）孵育，4℃，振荡2小时，然后离心，弃上清，再用PBS（含0.1％ Triton X -100）洗10次，0.1N甘氨酸（pH 2.2，含0.1%BSA）洗脱噬菌体，离心，弃沉淀。
上清中加入适量PEG/NaCl沉淀噬菌体， 8，000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用PBS洗2次后，沉淀溶于适量TE（pH 8.0）中，用该噬菌体再去感染适量的对数生长期的TG1菌体后，涂2YTAG平板，30℃培养过夜。
ELISA方法鉴定重组噬菌体抗体表达，简而言之，在重组噬菌体上清中加入PEG/ NaCl（2.5M NaCl中含20% PEG6000），冰上放置30-60分钟，10000rpm，4℃，离心20分钟，弃上清，立即用适量的2xYT或PBS溶解沉淀，加入事先已加好Raji靶细胞，孵育至少30分钟，用含有0.05% Tween-20的PBS（PBST）洗5次后，如上所述过程依次向反应体系中加入二抗、三抗进行反应，进行显色。重组噬菌体抗体binding活性鉴定：采用免疫组织化学法（ApAAp法）。
4、抗CD20嵌合抗体Fab构建
利用PCR法从抗CD20ScFv表达载体上分别扩增VH、VL基因，VH用引物1和2，VL用引物3和4，分别组装到带有人免疫球蛋白相应CH1、CL的pYZH、pYZL载体，将所得的重组子pYZHcd20、pYZLcd20扩增后，分别用MluI+NheI、SpeI+SphI消化，获得VL、VH的相应DNA片段，将这两个片段和经MluI+ SphI消化的pYZF载体所得的载体片段连接成抗CD20Fab表达载体pYZFcd20。
引物1：5-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTGAAGCTG-3
引物2：5-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT-3
引物3：5-GCTACAAACGCGTACGCTGACATCGAGCTC-3
引物4：5-TTTCAGCTCCACCTTGGTCC-3
5、抗CD20嵌合抗体（Fab）2构建
以质粒pYZFcd20为模板，利用PCR扩增并修饰CH1基因，酶切后组装到pYZF载体，构成表达载体pYZcpp3。
引物1： 5’- GTCTCCTCAGCCTCCACCAA-3
引物2：5’-GCCGTCGCATGCTCACGGTGGGCACGGAGGACAGGGTGGGCATGT GTGAGTTTTGTC-3’
6、抗CD20Fab和F（ab）2片段的表达及分离纯化
挑取将载体pYZFcd20转化16C9菌株的单菌落接种5ml含氨苄青霉素50g/ml的2×YT培养基（每1000ml含蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，pH7.4），37℃，200rpm，振荡培养6小时；6000rpm、4℃离心10分钟收集菌株。
将菌株重新悬浮于20ml含氨苄青霉素50g/ml的AP5培养基（每1000ml含葡萄糖15g，酪氨酸蛋白水解物11g，酵母提取物06g，硫酸镁0.19g，氯化铵1.07g，氯化钾3.73g，氯化钠1.2g，1M三乙醇胺120ml，pH7.4），30℃，250rpm，振荡培养20小时；6000rpm、4℃离心10分钟收集菌体，将菌体于-20℃冻存1hr以后，化冻，加1ml细菌周质腔蛋白提取液（三羟甲基氨基甲烷25mM，乙二胺四乙酸1mM，苯甲基磺酰氟0.1mM。
蔗糖20%（g/v），氯化钠200mM，过滤灭菌，100ml培养物/5ml细菌周质腔蛋白提取液），振荡混匀，置于4℃轻摇1小时，12000rpm，4℃离心20分钟，取上清。将提取物用PBS透析过夜，在FPLC上，用0.01M PBS pH7.4平衡Protein G Agarose 亲和层析柱，上样，先用0.01M PBS pH7.4平衡，至基线稳定后，用0.1M pH2.8甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱液。
7、Fab和F（ab）2竞争免疫荧光结合实验
将浓度为4ug/ul的HI47溶液与1106 Raji细胞在4度下孵育1小时，2000g，4度离心10min，弃上清液，PBS洗三次，将细胞重悬于20ug，30ul的抗CD20 Fab或F（ab）2片段溶液，4度放置1小时，2000g，4度离心10min，弃上清液，PBS洗三次，将细胞重悬于30ul的工作液羊抗鼠IgG-FITC溶液，4度放置30min，2000g离心10min，弃上清液，PBS洗三次，FACS测定HI47结合Raji细胞的阳性率。
8、Fab和F（ab）2对Raji、Daudi细胞毒作用
按1104细胞/孔接种96孔培养板，分别加入不同浓度的Fab或F（ab）2溶液，每个浓度做三个平行孔，37℃，5%CO2培养72小时，2000rpm离心10分钟，弃上清，每孔加入浓度为0.2mg/ml新鲜配置的MTT 200l，继续培养4小时，2000rpm离心10分钟，弃上清，每孔加DMSO 200l，振荡摇匀，546nm，测量OD值。
9、Fab和F（ab）2诱导Raji、Daudi 细胞凋亡实验
按1106细胞/孔接种24孔培养板，加入Fab溶液终浓度为50g/ml，每个样品做三个平行孔，以PBS为空白对照，37℃，5%CO2培养24小时，2000rpm离心10分钟，收集细胞，PBS洗2次，加70%的乙醇混匀，4℃，固定一小时，2000rpm离心10分钟，弃上清，PBS洗2次，加20l PI室温避光放置15分钟，FACS测定。
二、实验结果
1、抗CD20 ScFv 噬菌体显示文库建立、筛选及鉴定
CD20 ScFv噬菌体抗体库的大小约为3x106，即1微克DNA转化后获得106 个克隆。第一次panning前的文库大小为106，经5轮panning后，获得一均一文库，文库的大小约为107。
利用ELISA方法，以Daudi细胞为抗原，随机挑选14个克隆进行筛选，结果发现14个克隆均能与靶抗原有反应，其中以4（E4F4）、5（E5F5）、6（G4）、7（G5）、11（G9）克隆颜色较深，挑取6号克隆，利用APAAP法进一步检测其结合活性。
结果显示，克隆6的表达产物能和Daudi细胞特异结合。克隆6的测序结果和氨基酸序列分析表明该基因序列完全符合PDB库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列是一抗体基因序列。
2、抗CD20嵌合抗体Fab和F（ab）2的表达与纯化
SDS-PAGE电泳结果表明Protein G可有效纯化Fab和F（ab’）2表达产物。载体pYZFcd20的表达产物经Protein G纯化后，SDS-PAGE电泳可见在48KDa处有一条蛋白带，与Fab分子量相一致，而载体pYZcpp3的表达产物经Protein G纯化后，SDS-PAGE电泳可见在48KDa和97分子量各有一条带，前者与Fab分子量相一致，后者与F（ab’）2分子量一致。
经激光扫描分析显示Fab表达产物约占总蛋白量的30%，F（ab’）2约占15%。蛋白G亲合层析所得产物经巯基乙醇还原之后，纯化的Fab和F（ab’）2表达产物在25KDa处分别出现一条带，与轻重链的预期分子量相一致。F（ab’）2经S200分子筛柱分离纯化其纯度可达80%。
3、抗CD20嵌合抗体Fab和F（ab）2与Burkitt’s细胞的结合竞争实验
F（ab’）2与Raji和Daudi的结合阳性率可达95%以上，Fab结合阳性率可达57%，以上结果说明，我们表达的Fab、F（ab’）2 可以特异性的识别CD20+ 细胞，并与CD20相结合，Fab由于为单价，结合阳性率要小于F（ab’）2。
4、抗CD20嵌合抗体Fab和F（ab）2对Burkitt’s细胞的生长抑制作用
为了检验抗CD20抗体Fab的细胞毒性，以PBS为阴性对照，用MTT法分别测定Fab、F（ab’）2对Daudi、Raji细胞生长抑制作用。实验结果表明，F（ab’）2和Fab’对Raji 和Daudi细胞的生长都具有剂量依赖性的生长抑制作用，与Fab’相比，F（ab’）2对Raji 和Daudi细胞的生长抑制作用更强。F（ab’）2对Raji细胞的IC50值为22.8μg/ml；Fab’对Raji细胞的IC50值为45.9μg/ml，F（ab’）2对Daudi 细胞的IC50值为14.6μg/ml；Fab’对Daudi细胞的IC50值为39.5μg/ml。
5、FACS分析细胞凋亡率
流式细胞术进行分析结果显示：在G1期之前出现一个亚二倍体峰（凋亡峰）。用软件ModFitLT for Mac 2.0对流式细胞仪检测结果进行分析，得到用100μg/ml F（ab’）2处理Raji细胞在不同时间点的凋亡率分别为：24hr的凋亡率为26.9%、48hr的凋亡率为46.6%、72hr的凋亡率为53.4%、96hr的凋亡率为76.3%，与未用F（ab’）2处理的对照组相比，有显著性差异（P<0.001）。
6、抗CD20嵌合抗体Fab和F（ab）2对裸鼠移植瘤模型的治疗
体外生物学活性实验已证明：Fab’和F（ab’）2可以抑制Daudi、Raji这些CD20阳性细胞的生长，诱导Daudi、Raji细胞发生凋亡。为了进一步考察Fab’和F（ab’）2的抗肿瘤活性，我们建立了裸鼠移植瘤动物实验模型，并使用Fab’和F（ab’）2对荷瘤裸鼠进行治疗。
在进行治疗之前，挑选肿瘤大小均匀的荷瘤鼠，将其随机分成三组，每组5只，分别为治疗组和对照组；同时，测量每只鼠的体重和瘤块体积。经六次治疗之后，Fab’（50mg/kg，i.v.）和F（ab’）2 （50mg/kg，i.p.）对荷瘤鼠瘤块体积增长的抑制率分别为52.83%，64%。
三、讨论
长期以来肿瘤的临床治疗一直受到三大难题的困扰
1、常规的放、化疗方案选择性较差
2、肿瘤细胞产生耐药性
3、肿瘤病灶发生微小转移
肿瘤的免疫治疗为解决这些问题提供了一条新途径，其中，能靶向杀伤肿瘤细胞的特异性抗体疗法因具有较好的临床应用前景，现已成为这一新途径中的研究热点之一，并使得“肿瘤的导向治疗”更加接近现实。
在导向治疗中，嵌合抗体去除了鼠原性抗体中免疫原性较强的恒定区，已将鼠原性降到最低，减少了人抗鼠反应，因此最有应用前景。嵌合抗体在临床应用所引起的HAMA反应的发生率完全可为人们接受。例如人鼠嵌合抗体Rituximab，在临床上应用Rituximab 治疗非何杰金氏B细胞淋巴瘤所引起的HAMA反应并不多，166例病例中，仅有一例产生HAMA反应。
抗体可变区与抗原的结合不受糖基化的影响，因此可在无糖基化作用的大肠杆菌表达具有抗原结合功能的抗体活性片段，如Fv、Fab 、F（ab’）2和ScFv等分子。
虽然F（ab’）2不能引发抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒作用（CDCC），但F（ab’）2分子量较小，肿瘤穿透力较强，如果使用大肠杆菌表达，生产成本较低，便于工业化生产。
药代动力学研究表明，IgG、F（ab）2、 Fab、ScFv从血液到组织的血管渗出半衰期分别为6.1小时、4.4小时、0.4小时、0.5小时，在肿瘤部位滞留的生物半衰期分别为170小时、30小时、5.1小时、5.2小时。
Fab、ScFv具有较高的血液清除率，在静脉注射后，Fab和ScFv在肿瘤部位和血液中的分布也能很快达到较高的比例，但由于Fab和ScFv是单价的抗体，亲和力较低，解离常数较高，导致Fab和ScFv在肿瘤部位的滞留时间较短，而双价的F（ab）2既具有较高的血液清除率，在肿瘤部位滞留的时间也较长，因此利用抗体治疗肿瘤时，临床应用中以F（ab）2的形式比较恰当。
此外，Fab’可以应用于显象定位，F（ab）2可以和一些放射性元素或毒素结合，作为载体应用临床。基于以上几点，我们研究室开发了抗CD20嵌合抗体片段Fab’和F（ab）2，简化了生产步骤，生产成本相对低于同类产品，体内体外实验结果均证明它们是适于临床应用的抗体片段，应用前景诱人。
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