【原创】莱枫-血清/血浆游离DNA提取试剂盒

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各位战友如有需要我们可提供4次免费试用装

个人认为彻底去除细胞DNA是实验可重复性的关键，后续PCR添加BSA或Carrier DNA或增强剂是非常有必要的。

我们旨在提供一种更方便、快速和稳定的提取方法，没有文献或者公司产品支持游离DNA可电泳观察，虽然我们做到了，这也是锦上添花的事，因为现有的检测方法完全可以实现更微量核酸的检测工作。

血清/血浆游离DNA提取试剂盒 Cat#DK606

游离DNA(或称循环DNA，以下简称cfDNA)是一种无细胞状态的、片段化的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。cfDNA在正常人的血液中含量甚微，平均值为13 ng/ml[1]，而当机体在一些特殊状态时(如患有肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、中风、心肌梗死及妊娠等)，其含量明显上升，比如恶性肿瘤患者平均值达到180ng/ml[1]。

cfDNA含量少，而且高度片段化，提取cfDNA往往成为后续实验成败的关键。DK606是针对cfDNA的特点而设计的，适合从≤5ml血清或者EDTA-K2(或Na2)抗凝方式的血浆中提取DNA，具备以下特点：

富集DNA，避免反复过柱

样品中加入等体积DNA富集试剂，使DNA与少量蛋白形成容易被离心沉淀的复合物，≤2ml样品只需过柱结合一次，2-5ml样品过柱结合2次。平行处理4个体积为1ml的样品，可在30分钟内完成提取工作。

回收率约50%，可电泳观察

我们优化了DNA与硅胶材料的结合方式，不添加carrier RNA/DNA的条件下避免硅胶材料不可逆吸附核酸造成的损失，cfDNA回收率约50%，高于文献THP(Triton/Heat/Phenol protocol)的回收率(38.7%)[2]。

≥0.5 ml样品最终20 μl洗脱，5 μl电泳即可观察到核小体单位的143 bp片段，可作为估算cfDNA含量的依据。

解决长时间冻存的血浆样品中血纤维影响产量和纯度的问题

血浆长时间冻存或者反复冻融后产生血纤维，大量血纤维会影响cfDNA产量和纯度。cfDNA以某种方式附着或者结合于血纤维，因此不能简单离心去除血纤维。我们优化的方法能使cfDNA与血纤维分离，方便离心去除血纤维，并且能去除大部分可能残留的细胞DNA(见图2、3)。

cfDNA提取与后续实验的建议

1. 血清和血浆都可以用于提取cfDNA，普遍认为血液在凝固过程中发生凋亡释放DNA到血清中，因此从血浆中提取cfDNA更能反映生理或者病理状态。

2. 推荐使用EDTA-K2作为抗凝剂分离血浆。

3. 推荐2次离心的方法分离血浆[3]：1600g离心10min分离血浆勿触动白膜层，16,000g离心10min仔细吸取上清。

4. cfDNA量极少，后续PCR(包括Realtime PCR)应考虑高温条件下反应管表面对核酸的吸附和破坏作用。提取方法中加入carrier RNA/DNA最终存在于提取的cfDNA中，对后续PCR是有利的，但carrier RNA容易水解和降解可能会影响实验的重复性。

BSA对塑料表面有屏蔽作用，大部分公司提供的PCR试剂中已含有一定量的BSA(终浓度约0.008%)，我们建议在PCR体系中再添加BSA至终浓度0.1%；或者添加carrier DNA至终浓度0.5-5ng/μl；或者添加5×PCR Enhancer II (Cat#PR312)。

Carrier DNA可以是已知序列的基因组DNA、质粒DNA或者PCR产物，carrier DNA与检测引物不能与有稳定配对区域，比如检测癌突变序列可以使用正常组织或者血液中提取的DNA作为carrier DNA。对PCR的增强效果，添加Carrier DNA优于添加5×PCR Enhancer II ，优于添加BSA。

参考文献

1. Gormally E, Hainaut P, Caboux E, et al. Amount of DNA in plasma and cancer risk: aprospective study. Int J Cancer 2004;111:746–9.

2. Xiaoyan Xue, et al. Optimizing the yield and utility of circulating cell-free DNA from plasma and serum. Clinica Chimica Acta 2009;404:100–04.

3. Rossa W. K. Chiu, et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Fetal and Total DNA Quantification in Maternal Plasma. Clin Chem 2001; 47: 1607–1613

以下图1-4说明：

Marker为Marker I (100-600 bp)稀释10倍，M1表示1μl，M2表示2μl，M3表示3μl。以M1为例400bp为加亮条带图中为2ng，其余条带为1ng；

样品洗脱体积为20 μl，电泳体积5μl；

电泳条件：1×TAE，1.5%agarose, 6.7V/cm电泳15min；

Bio-rad凝胶成像系统拍摄。