免疫PCR技术进展

免疫-PCR技术结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性，是一种极为敏感的抗原检测技术，并适合于各种微量抗原的检测。

荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很高的灵敏度。但在早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏度。

放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到1ng/ml，但在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用。1992年，Sano[1]等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR（Immuno-PCR）。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处。

众所周知，PCR技自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术，也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。

而免疫-PCR技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。

1、 免疫-PCR的基本原理

免疫-PCR主要由两个部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（ELISA）的抗原抗体反应。第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。

免疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫-PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。

由于PCR的高扩增能力，只要存在着极微量的抗原抗体反应，PCR都能大量扩增抗体所连接的DNA分子，再用电泳来表明实验结果。免疫-PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。

最初Sano等人建立的免疫-PCR实验流程如下：

（1）再包被缓冲液稀释抗原BSSA，并固定在微滴定板上。

（2）微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体，并洗去未结合的抗体分子。

（3）加入稀释的已与生物素化PUC19的结合的链亲和素-蛋白A嵌合体（蛋白A能与抗体结合，而链亲和素可与生物素化PUC19中的生物素结合），并洗去未结合的嵌合蛋白-Puc19复合物。

（4）PCR扩增抗体所连接的Puc19。

（5）琼脂糖凝胶电泳，EB显色检测Puc19.

运用这种方法，Sano等人可检测到600个BSA抗原分子。与用碱性磷酸酶作为标记物的ELISA方法相比，免疫-PCR的敏感度比ELISA高106。在这免疫-PCR系统中，链亲和素-蛋白A嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用。

它的两个独立结合位点蛋白A和链亲和素分别与IgG的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合，从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系，通过PCR扩增，将抗原抗体反应的特异性高度放大。因此，免疫-PCR结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高度敏感性，成为一种极为敏感的抗体依赖的抗原检测技术。

2 、免疫-PCR的改进

虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了它在实际应用中的广泛普及。

Ruzicka[2]等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。

此外，Sano的免疫-PCR实验流程需要众多的洗涤步骤，使实验过程相当繁琐，并需要大量的操作时间。Zhou[3]等人对此作了改进，他们用生物素化的二抗和游离链亲和素作为连接分子进行免疫-PCR实验，把每个步骤的洗涤次数从原先的7～15次减至3～5次，从而减少了操作时间，但不影响实验结果的准确性。

另外，用修饰过的抗原稀释缓冲液（modified antigen dilution buffer, MADB）代替Sano免疫-PCR中的TBS作为抗原稀释液，它主要把TBS中胍的浓度调到2M，由此解决了抗原的溶解问题。Zhou检测了人原癌基因ETSI，检测浓度可达到9.6×10-15M，是常规ELISA的105倍。

与Sano的免疫-PCR系统相比，Ruizicka和Zhou所用的方法不需要特殊的试剂，生物素和亲和素（链亲和素）都已经商品化，因此在实际操作中得到广泛应用[4]。但直接包被待检抗原不适用于临床标本和难以吸附固相抗原的检测。

随后在一系列实验中建立了各种夹心免疫-PCR[5～10]，扩大了检测范围。然而亲和素（链亲和素）作为一个连接分子对生物素的结合具有4价特性，亲和素与生物素化DNA结合可得到5种不同产物，即游离亲和素、结合饱和亲和素和部分饱和亲和素才能在检测过程中发挥作用，游离亲和素与固相中生物素化抗体结合会降低方法的敏感性[11]。

3、 多分析物免疫-PCR

在以上的免疫-PCR实验中，生物素化的DNA通过不同的生物素结合试剂（链亲和素、亲和素）连接到生物素化的抗体上。这样，DNA标记和抗体就被组装在同一位点上，因此可能产生可变的化学计量。

另外它需要额外的步骤加入生物素试剂和连接试剂，并需要众多的洗涤步骤去除过量的试剂和非特异性连接试剂的实验组分，作为一个免疫-PCR实验就相当复杂且需要相当多的操作时间。

Hendrickson[12]等人用异双功能化学交联剂预先连接好抗体和ssDNA标记，形成标记DNA-抗体偶联物。特别是，他将不同的抗体标上特异的DNA序列，形成一种新的、基于双抗夹心免疫模式的免疫-PCR，并可同时检测多种抗原，避免了免疫实验敏感性的限制和在一个实验中检测抗原的种类。

而且，免疫-PCR夹心模式可以用常规的免疫实验完成。这样就大大降低了原先免疫-PCR实验的复杂性，并减少了大量的操作时间。这种免疫-PCR系统的关键改进就是用异双功能化学关联剂制备标记DNA-抗体偶联物。制备过程如下。

（1）氨基修饰寡核苷酸与SATA反应，形成乙酰硫代乙酰修饰DNA。

（2）Sulfo-SMCC与抗体反应，形成马来酰亚胺修饰抗体。

（3）混合马来酰亚胺修饰抗体和乙酰硫代乙酰修饰DNA，并加入羟胺盐酸，在黑暗条件下反应，使抗体和标记DNA偶联。

（4）反应混合物用HPLC凝胶过滤纯化偶联物，收集的偶联物在4℃下保存。

在这偶联物中，ssDNA是连在抗体的Fc段上，因此并不影响抗体的活性。Hendrickson用此方法把设计独特的三种寡核苷酸（分别为55、85、95个碱基）分别共价连接到三种分析物hTSH、hCG、β-Gal的特异性抗体上，每一个寡核苷酸标记物含有相同的引物序列。这样，一对引物就可以促成三种DNA的共同扩增，Hendrickson用预先制备好的三种抗体-RNA偶联物同时检测hTSH、hCG、β-Gal实验使用双抗夹心模式。实验结果表明，分析物检测的敏感度超过普通ELISA约三个数量级。

由于化学合成寡核苷酸标记物序列长度不能超过100个碱基。因此，在多分析物免疫-PCR实验中，ssDNA标记物和引物的设计就受到了限制。Joerger[13]等人用dsDNA作为标记物与抗体偶联。几千个bp的dsDNA可以通过生物学和生物化学方法制备。Joerger通过PCR和单向缺失在以Puc18为基础的重组质粒上制备了各种长度、具有相同引物序列的的dsDNA，选择适合长度的dsDNA作为特异性抗体的标记物。另外，在免疫-PCR实验中，dsDNA比ssDNA具有更多的优越性。DsDNA中的一条链跟抗体的Fc段连接，另一条链在PCR第一步变性步骤中就释放到溶液中，使链复制没有空间位阻。而且dsDNA比ssDNA具有更高的稳定性。此外，长链DNA分子更容易用荧光标记和光吸收检测，并且可以引入更多的非同位素标记，序列长度的提高可以促进杂合检测。

4、 免疫-PCR扩增产物的ELISA检测
  　　
pCR扩增产物一般是通过凝胶电泳、EB染色来检测并定量的。也有的是在凝胶电泳后用Southern杂交来检测PCR产物[8,9,14]。1997年，Niemeyer[15]提出所谓的免疫-PCR和PCR-ELISA检测，即用ELISA方法来检测并定量PcR产物。它主要是用一对分别标记了生物素和捕获抗体固定扩增产物，用标记上碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA。Niemeyer分别检测了鼠IgG、兔IgG和重组HbsAg，证实与凝胶电泳、EB显色相比，ELISA方法检测定量PCR扩增产物结果具有更高的稳定性和可重复性。凝胶电泳、EB显色的变异系数（CV）达到38％，而ELISA的变异系数只有10％。而且，以荧光染料AttoPhos作为显色底物的ELISA检测灵敏度比凝胶电泳、EB显色高10倍。另外，荧光强度和抗原检测量的相关系数也高达99％。这种PCR-ELISA更节省时间，且易于自动化操作和便于临床检测。

5、展望

免疫-PCR作为一种抗原检测系统，同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性、适合于各种微量抗原的检测[16]，并且可以直接检测细胞上抗原[14]。预先将抗体和标记DNA偶联，简化了实验操作，并可以同时检测多种抗原。而标记物和引物被设计为带有亲和配体，则可以用常规ELISA方法进行检测。随着免疫-PCR技术的进一步发展完善，免疫-PCR的功能将得到更充分的发展，新的标记物和引物设计将扩展可检测分析的范围，简化实验的复杂性。具有侧链DNA标记物的偶联物能够承担的标记物的检测，产生更准确的结果。相信不久就会有商品化的免疫-PCR试剂盒问世。