免疫-PCR技术进展

 

荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很高的灵敏度。但在早期癌抗原及某些神经肽等极微量抗原检测上，荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏度。放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到1ng/ml，但在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用。1992年，Sano[1]等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR（Immuno-PCR）。它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之处。

 

众所周知，PCR技自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术，也是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。而免疫-PCR技术正是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。

 

1 免疫-PCR的基本原理

 

免疫-PCR主要由两个部分组成。第一部分是类似于普通酶联免疫吸附实验（ELISA）的抗原抗体反应。第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。免疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果，而免疫-PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，并进行电泳检测，因此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR的高扩增能力，只要存在着极微量的抗原抗体反应，PCR都能大量扩增抗体所连接的DNA分子，再用电泳来表明实验结果。免疫-PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白质的检测转变为对核酸的检测。最初Sano等人建立的免疫-PCR实验流程如下：（1）再包被缓冲液稀释抗原BSSA，并固定在微滴定板上。（2）微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体，并洗去未结合的抗体分子。（3）加入稀释的已与生物素化PUC19的结合的链亲和素-蛋白A嵌合体（蛋白A能与抗体结合，而链亲和素可与生物素化PUC19中的生物素结合），并洗去未结合的嵌合蛋白-Puc19复合物。（4）PCR扩增抗体所连接的Puc19。（5）琼脂糖凝胶电泳，EB显色检测Puc19.

 

运用这种方法，Sano等人可检测到600个BSA抗原分子。与用碱性磷酸酶作为标记物的ELISA方法相比，免疫-PCR的敏感度比ELISA高106。在这免疫-PCR系统中，链亲和素-蛋白A嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用。它的两个独立结合位点蛋白A和链亲和素分别与IgG的Fc段和生物素化DNA中的生物素结合，从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系，通过PCR扩增，将抗原抗体反应的特异性高度放大。因此，免疫-PCR结合了抗原抗体反应的特异性和PCR的高度敏感性，成为一种极为敏感的抗体依赖的抗原检测技术。

 

2 免疫-PCR的改进

 

虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子链亲和素-蛋白A嵌合体还没有商品化，因此限制了它在实际应用中的广泛普及。Ruzicka[2]等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR系统中的抗体，用商品化的亲和素代替链亲和素-蛋白A嵌合体作为连接分子构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fg/ml的E抗体。