自身免疫法

试剂：

① Tris-HCl 缓冲液；

② 弗氏不完全佐剂和卡介苗（10 mg/ml）；

③ 弗氏完全佐剂（complete Freund adjuvant, CFA）；

④ CFA-pZP3 混合液。

实验动物：

小鼠、大鼠、猴、兔等。

自身免疫法的基本过程可分为如下几步：

A. 粗卵巢抗原法。取性成熟 BALB/c 小鼠卵巢组织，在 Tris-HCl 缓冲液中将组织剪碎并研磨成匀浆，低温下超声粉碎 5 分钟并离心（4000 r/min，15 分钟；10 000 r/min，5 分钟），取上清液（其中蛋白含量为 21.7 mg/ml）加入等量弗氏不完全佐剂和卡介苗（10 mg/ml），碾磨成乳化状，在 BALB/e 小鼠腹部及足底多点皮下注射，总量为每只 0.2 ml（含卵巢组织每只 15 mg），同时在小鼠尾静脉注射百日咳疫苗 0.1 ml（10 x 10¹⁰/ml）。每 3 周加强免疫 1 次。

B. 透明带抗原免疫法。机械绞碎猪卵巢，经尼龙筛过滤，吸取卵母细胞，65 ℃ 水浴 1 小时，离心后收集上清液经凝胶层析，收集主峰蛋白，透析浓缩，与弗氏完全佐剂（complete Freund adjuvant, CFA）混合乳化作为抗原。以皮内及两后脚掌多点注射免疫 BALB/e 小鼠，免疫剂量为每次 10 μg，每 2 周免疫 1 次，连续免疫 3 次。此外，用小鼠透明带 3（PZP3）的第 330～342 个氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），合成透明带多肽，与弗氏完全佐剂按 1:1 乳化。于雌性小鼠双后脚掌处进行皮下注射 CFA-pZP3 混合液 0.1 ml，其中包含 pZP 350 nmol/L，可以产生卵巢炎。肌内注射人或猴透明带 3 合成的多肽及佐剂免疫短尾猴也可得到 POF 模型。

C. 胸腺切除法。给出生 3 天以内的 BALB/e 鼠低温下麻醉并切开胸骨，用玻璃吸管吸出两片胸腺，然后封闭切口与母鼠同笼饲养，3～4 周后可见大量的卵泡受到淋巴细胞浸润破坏，随后出现卵巢萎缩。该模型是由 T 细胞介导的，小鼠产生了一-种血清抗体对卵泡液中的抗原起反应。