R&D Systems支原体污染检测新方法（ELISA）专辑

R&D Systems支原体污染检测新方法（ELISA）专辑

不需要特殊仪器，可同时检测8种支原体，并避免支原体检测出现假阴性和假阳性的方法

前言：
      支 原体污染是细胞培养中令人头痛的问题，有研究表明25%的细胞系中感染了支原体，而研究人员却并不知晓！支原体检测常规采用PCR的方法，虽然灵敏，但假 阳性和假阴性率高，面对得之不易的细胞，研究人员往往很难取舍。对此，R&D Systems 公司在这个领域有重大突破，利用Elisa技术研发的新产品—MycoProbe® Mycoplasma Detection Kit（Catalog # CUL001B）可以高通量（96undefined8种支原体）快速（检测时间也仅需要4.5个小时）有效地检测支原体污染，并且避免出现假阴性和假阳性现象。

      支 原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。细胞培养（特别是传 代细胞）被支原体污染是个世界性问题。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达，又不能通过可视 法对其进行检测，而且它对细胞的生长率影响较小，不易引起注意。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、 培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

      一．R&D Systems  MycoProbe®试剂盒原理： 该试剂盒运用“Elisa夹心法”的基本原理，首先将样品16S ribosomal RNA (rRNA)标上生物素标签和地高辛标签，然后将其加入预先包被在孔板上的链亲和素的微孔板进行捕获，同时加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛检测抗体检测，最 后加入底物显色，通过比色法得出检测结果。

二．R&D Systems MycoProbe®试剂盒的特点和优势：

      1. 试 验结果准确。以往采用PCR法检测支原体污染时，多重扩增可导致假阳性，而且过量样品的使用可导致假阴性。同时运用荧光染色方法时由于支原体吸附在细胞上 而不易上色从而检测不到支原体的污染（假阴性）。而R&D Systems MycoProbe®试剂盒，通过“核苷酸夹心”原理的新方法，采用标记了碱性磷酸酶的寡核苷酸探针与16S核糖体RNA杂交，随后检测底物证实支原体是 否存在，可以有效避免了PCR法出现的假阴性和假阳性现象，检测结果准确。
 

PCR与MycoProbe®方法检测支原体结果对比：

2. 省时省力更经济。通过PCR方法检测支原体污染通 常需要1天时间。通过培养法检测，虽然检测结果较好，但是培养过程需要时间很长，并且操作繁琐。以上两种主要采用的方法均耗时耗力。而通过R&D Systems MycoProbe®试剂盒检测支原体，方法简单易操作，检测时间仅仅需要4-5小时，并且价格低廉。

      3.高灵敏度和高通量。该试剂盒具有较高灵敏度（下图为与PCR法的比较），同时使用标准的96微孔板形式一次可以检测96个样本。

4.适用范围广。试剂盒可用于检测细胞裂解蛋白或细胞上清。
可以检测涵盖95％污染细胞培养的8种支原体。包括：
 

M. hyorhinis
M. arginini
M. fermentans
M. orale
M. pirum
M. hominis
M. salivarium
A. laidlawii

三．MycoProbe®试剂盒的详细介绍
1. 试剂盒成分：
    细胞裂解液 ，Cell Lysis Buffer
    杂交板96孔板， Hybridization Plate
    链亲和素捕获板96孔板， Streptavidin Capture Plate
    样品稀释液 ，Sample Diluents
    碱性磷酸酶标记的抗地高辛检测抗体 ，Anti-digoxigenin conjugated to alkaline phosphatase
    捕获探针，Capture Probes
    检测探针，Detection Probes
    阳性对照 ，Synthetic DNA Oligonucleotide Positive Control
    洗脱液，Wash Buffer
    底物及其稀释液，Substrate（NADPH）
    信号放大酶及其稀释液，Amplifier enzymes
    终止液 ，Stop Solution
    浮漂 ，Float Collar
    板封口条 ，Plate Sealers
    使用说明书 ，Protocol Manual
（具体试剂盒组分详见英文说明书，产品说明书：http://www.rndsystems.com/pdf/CUL001B.pdf）
2.试剂的储存
    未开封的试剂盒可以储存2 - 8° C；请在有效期内使用。
    开封后的试剂盒后试剂分别保存，详见英文说明书。
3.其他实验需要的准备
    酶标仪
    移液器和枪头
    去离子水，无RNA酶
    100 mL 和 1000 mL量筒
    水平微孔板摇床
    涡轮混合器
    手套和面具

4. 主要的实验操作流程
  A.细胞裂解或细胞上清液准备。若为细胞，终浓度达到1.25x106cells/mL；若为细胞上清，10倍稀释。
  B. 预先润洗杂交板。
  C. 将“探针”加入杂交板微孔中。
  D．将样品、阳性对照、阴性对照加入微孔中，65℃水浴60分钟“杂交”后在洗脱。
  E. 预先润洗带有链亲和素的板。
  F. 将标记好的样本加入带有链亲和素板的微孔中，室温孵育60分钟进行“捕获”。
  G．加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛的检测抗体，室温孵育60分钟进行“检测”。
  H. 加入信号放大酶，进行信号放大或者扩增。
  I．加入底物孵育30分钟。
J. 加入终止液，在490nm显色。

5.实验结果参照
①样品的阳性结果的OD值应≥1.5，可以以下表做比对。

②检测的样本应达到一定检测量，下表为最低可检测量。

6.相关文献 REFERENCES
1. Hay, R.J. et al. (1989) Nature 339:487.
2. Razin, S. et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:1094.
3. McGarrity, G.J. et al. (1984) In Vitro 20:1.
4. McGarrity, G.J. and H. Kotani (1985) in The Mycoplasma: Cell Culture Mycoplasmas, Volume IV,
Eds. Razin, S. and M.F. Barile (Academic Press, New York), pp. 353 - 390.
5. McGarrity, G.J. et al. (1979) In Vitro 15:73.
6. Masover, G.K. and F.A. Becker (1998) Methods Mol. Biol. 104:207.
7. Masover, G.K. and F.A. Becker (1998) Methods Mol. Biol. 104:217.
8. Gabridge, M.G. et al. (1986) In Vitro Cell Dev. Biol. 22:491.
9. Garner, C.M. et al. (2000) Br. J. Biomed. Sci. 57:295.
10. Wirth, M. et al. (1994) Cytotechnology 16:67.
11. van Kuppeveld, F.J. et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:149.
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13. Uphoff, C.C. and H.G. Drexler (2002) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38:79.
14. Razin, S. (1994) Mol. Cell Probes 8:497.
15. Hopert, A. et al. (1993) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29A:819.
16. Blanchard, A. et al. (1991) FEMS Microbiol. Lett. 65:37.
17. Hatanaka, M. et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1401.

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