酵母双杂交文库及抑制消减杂交技术

酵母双杂交文库

蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础，酵母双杂交及其衍生技术将在功能基因组学和蛋白质组学的研究中发挥越来越重要的作用。 酵母双杂交(yeast two hybrid) 技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一,获得了许多有价值的重要发现。该方法建立以来，经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。

基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。如利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能；利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用；利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响；利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）．

目前市场上成熟的构建酵母双杂交文库的技术路线主要有Clontech的同源重组方法和Invitrogen的Gateway技术，两个技术路线的特点比较如下：

上海欧易生物医学科技有限公司在长期稳定的实验服务过程中积累了丰富的经验，已经成功构建包括大鼠、水稻、拟南芥和油菜等几十个物种的酵母双杂交文库。他们提供两种文库构建方法，一种是在Clontech的技术体系上增加了均一化技术，有效富集低丰度表达基因，从而降低冗余率；一种是结合Invitrogen的技术体系建库插入长度较长的优势结合Clontech的技术体系筛库比较方便，文库构建在改造后的载体上来和BD载体共转筛库。

抑制消减杂交技术（SSH）

抑制消减杂交技术（SSH）是一种比较和分离不同细胞系、不同组织间或同一细胞系、同一组织间在不同条件下差别表达基因的方法。它主要基于抑制性PCR , 并结合均一化和消减杂交的技术，在非目的双链片段两端接上同一接头，使其具有反向末端重复序列,在 PCR 中不能扩增, 从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。均一化步骤平衡了目的基因群中cDNA 的丰度, 即低丰度差异表达的基因不会丢失,而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离，消减杂交则消除了目的基因群( tester) 与驱赶基因群(driver) 间的同源序列。高富集度，低背景和消减混合物中cDNA丰度的均一化使SSH成为差异表达基因cDNA快速克隆的理想方法。更重要的是，用未被克隆的消减cDNA混合物作为杂交的探针的可行性使SSH成为通用、强有力技术。

SSH 具有快速、灵敏、高效、假阳性率低且所需mRNA 量较少等优点。采用该技术一般3～ 4天即可获得差异表达基因的cDNA 片段, 在标准体系中, 运用SSH 进行一轮消减杂交, 可富集稀有序列1000 倍以上, 使某些低丰度表达的mRNA有望被检出。有研究表明, SSH 的阳性率达94% , 可同时分离出上百个差异表达基因。

SSH 技术在医学和实验动物基因克隆方面已有较成熟的应用，对生物发生、发展及疾病形成过程中基因表达变化和差异基因鉴定以及新基因功能的认识和调控等方面发挥巨大的应用潜能, 拓展更广阔的应用前景。

上海欧易生物医学科技有限公司在构建SSH文库方面具有丰富的经验，成功为各领域客户构建了上百个各类SSH文库，物种涉及植物、动物、微生物等。同时，不仅能够分离mRNA建库，而且在客户不能提供足量RNA时，采用SMART技术也能构建质量稳定可靠的文库，为客户节省大量精力和时间。