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Raf 蛋白 Ras 结合结构域的简并进化库合成以及利用片段互补法快速筛选二氢叶酸还原酶的快速折叠且稳定的克隆

丁香园

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1. 引言

随着 20 世纪七八十年代重组 DNA 技术的出现,已发展出大量的合成和筛选寡核苷酸文库的新方法,用于研究和了解是哪些序列编码了具有期望特性的新蛋白质,这些特性包括在特定条件下酶的活性、结合力以及蛋白质的稳定性 [ 1〜8 ] 。对于任何一个给定的例子,要进行此类蛋白质的工程研究,必须具备两个条件:构建多样化序列文库的策略和从文库中筛选具有特定性质产物的有效方法。其中,选择何种方法合成文库至关重要,因为这决定了文库能否提供大量充足的筛选空间,从而最大限度的为得到编码蛋白质特定性质的序列提供最多的选择。因此,发展构建文库的策略毫无疑问一直是这个领域的研究焦点。过去的文献,报道了一些将蛋白质中的某区域完全随机化或高度简并化的例子,以回答关于蛋白质折叠的问题 [ 9,10 ]。然而,关于真正建立高度简并文库,寻找编码新的折叠、结合能力或酶活的序列的报道仍很少见 [ 6,11] 。构建高度随机文库固有的以及随后在大量时序列库中寻找编码特定性质的少数序列的局限性,推进了新方法的设计和开发,这其中就包括 DNA 混编(DNA  shuffling ) 策略或允许毫无序列相似性的基因间重组的新方法 [ 12〜18] 。

如果没有适当的筛选策略,即使文库设计得再精巧也无法得到有用的产物。例如,在一个文库中筛选编码具有特定酶活、稳定性或结合靶标蛋白能力的蛋白质的理想方法是,在某细胞或有机体中表达该文库,而库中具有所需性质的成员可以在特定的条件或基因背景下,在特定的选择培养基中生长[1,19〜22 ]。但是,这种例子是极为
少见的,所以从事蛋白质工程研究的人员一直在寻求可以更为普遍应用的文库筛选方法 [ 23〜26 ]。更具体地说,结合检测经常可以用于在一个 DNA 文库中筛选表达正确折叠的、稳定的和可以与其他分子(蛋白质、核酸、有机底物、过渡态类似物等)结合的多肽。目前建立的最完善的方法是噬菌体展示 [4,5,27];综述 [ 28 〜30 ],该方法将文库的扩增和筛选分开,分别在体内和体外进行,适用于与可以容易地固定在固体介质上的小分子或小肽结合的蛋白质,但不太适用于蛋白质与蛋白质相互作用研究或文库间筛选。近来,蛋白质片段互补检测(PCA) 成为一个替代选择 [ 31〜34 ] 。PCA 的策略是,将两个蛋白质分别与报告蛋白或酶的两个片段融合表达,两个目的蛋白的结合将报告蛋白的两个片段连在一起,从而使报告蛋白具有可以检测的功能。例如,以鼠二氢叶酸还原酶(mDHFR) 作为报告蛋白,在大肠杆菌中利用简单的存活选择实验进行文库筛选的方法已经建立起来[ 32] 。与在所有的原核和真核细胞中相同,在大肠杆菌中,DHFR 的产物四氢叶酸是合成胸腺嘧啶、甘氨酸、丝氨酸和腺嘌呤所必需的,在原核生物中,它还是合成泛酸所必需的。因此,在不提供 DHFR 终产物的条件下,DHFR 的活性显然对于细胞生长和分裂是不可缺少的。用甲氧苄氨嘧啶(trim ethop rim,叶酸类似物,
其抑制大肠杆菌 DHFR 的能力是抑制哺乳动物 DHFR 的 12000 倍)处理的大肠杆菌的生长依赖于重组 mDHFR 的表达 [ 35 ] 。这样,将两个目的蛋白分别与 DHFR 的两个片段融合并共表达,如果两个蛋白质之间有相互作用,则大肠杆菌可以在添加了甲氧苄氨嘧啶的基本培养基上生长 [31]。在一个最初的文库间筛选中,DHFRPCA 被用于从含有 6 X1010 个可能结合的序列的单独文库中鉴定出可以形成最优的形成亮氨酸拉链的异源二聚体序列。竞争实验(competition experiment) 和 “文库混编” (library  shuffling)  策略旨在改善文库筛选的覆盖范围 ,进一步优化形成二聚体的蛋白质对,并最终找到一个 “成功的蛋白质对” [ 32,36] 。近来,DHFR  PCA 经修改用于在体内筛选单链抗体 [37]。DHFR  PCA 策略将基因筛选整合的方法,是可以简化文库间筛选的关键,因为在若干的循环中选择压力同时施加于两个文库上,从而避免了如噬菌体展示技术那样将文库扩增和筛选分开进行,这使 DHFR  PCA 真正可以用来研究寡聚体序列的同时进化。

亮氨酸拉链例子的结果使我们相信 DHFR  PCA 可以用于解决更具挑战性的问题。在此例中,仅仅改变了几个关键氨基酸的位置,而且只有 2〜4 个氨基酸可以被替换。基于之前的理论研究 [38],我们试图严格并全面的测定使 Ser/Thr 蛋白激酶 raf 的 ras 结合结构域(RBD) 正确折叠的序列决定因素同之前发表噬菌体展示策略类似,我们所用方法的目标是鉴定出蛋白质折叠和稳定所必需的序列 [40]。其原理是:如果一个给定的 RBD 变体可以快速正确的折叠并足够稳定,那么它应该可以与 ras 相互作用。将 RBD 文库和 ras 分别与 DHFR 两个互补的片段融合并在大肠杆菌中共表达,在本节上述的选择压力下,RBD 文库中可以快速折叠的稳定成员将与 ras 相互作用,使 DHFR 恢复活性从而使得大肠杆菌可以生长。我们选择了一个高效且现实可行的方法设计文库,最大限度的开发了其序列多样性并将文库限定在合理的大小。基于此研究提出的问题,一个有意义的扩展序列筛选空间的方法是,在构建文库时每次只改变一小段连续的氨基酸残基 [ 10 ]。经过对 RBD 结构的研究,我们发现可以将其分割成 13 个区域,分别对应多个独立的 β 转角或环、β 链和一个 α 螺旋(我们构建了两个文库,分别对应该区域的 N 端和 C 端),其长度为 4〜8 个残基 [41,42] 。以此为依据,我们构建了 13 个简并进化库,用 NNK  ( 其中 N 表示任何核苷酸,K 表示 G 或 T ) 取代野生型蛋白的密码子,这就使得 20 种氨基酸中的任何一种都可以插入到每个可变区。然后,在大肠杆菌中利用 DHFR PCA 筛选这些文库中可以与 ras 结合的成员。除了筛选可以完全在体内进行,该方法最大的优点是得到的文库中可以与 ras 相互作用的成员无需更换表达系统
即可用于纯化和生理分析。

基于在设计和合成文库以及用 DHFR  PCA 对文库进行筛选过程中遇到的技术挑战,在此我们介绍了实验方法和问题解决策略。希望这些方法足够全面,不仅对对折叠有兴趣的人有用,而且对解决优化蛋白质之间的相互作用的问题也有帮助。

2. 材料

2.1 文库合成

( 1 ) 寡核苷酸引物(IDT):引物中含有可以与多种碱基配对的位点,以确保获得期望的碱基插入。引物是 SDS-PAGE 纯化得到的。

( 2 ) Tag 聚合酶(Fermentas)。

( 3 ) 琼脂糖凝胶:agarose (Bioshop) Dark reader™ (Clare Chemical Research ) 和 GelstarTM  ( Biowittaker Molecular Applications)。

( 4 ) 凝胶纯化试剂盒:QIAEX™II 或 QIAquick™gelextractionkit ( Qiagen) 更好。

2.2 文库的克隆和纯化

( 1 ) 质粒 PQE-32△F [ 1,2 ] ( 在 Qiagen 的质粒 pEQ-32 的基础上构建而成,F [ 1,2 ] 代表 DHFR 片段 1 )。

( 2 ) 质粒 pREP4 ( 携带 lac 抑制基因和卡那霉素抗性筛选标记。含有利用质粒 PQE-32 表达的蛋白质的细胞,正如本实验所用的,必须带有此质粒以控制 PQE-32 质粒上 lac 启动子的泄漏表达)(Qiagen 产品)。

( 3 ) 连接:T4 DNA 连接酶(Fermentas) 和  ATP ( Pharmacia)。

( 4 ) SS320 电转感受态细胞(见 15.2.7)。

( 5 ) Genepulser™II 电转仪(Bio- Rad)。

( 6 ) 槽宽 2 mm 的电转杯(Invitrogen)。

( 7 ) 10 ml SOC 培养基:1% 蛋白胨、0.5% 酵母粉、1% NaCl、0.4% 葡萄糖、2.5 mmol/L KCl 和 10 mmol/L  MgCl2

( 8 ) 含 10 μg/ml 四环素、10 μg/ml 壮观霉素(spectinomycin) 和 10 μg/ml 氨芐青霉素的 LB 固体培养基。

( 9 ) 每文库 100〜250 ml LB 培养基。LB 培养基中添加 0.2% 葡萄糖、0.25 倍的 M9 盐溶液、10 μg/ml 四环素、10 μg/ml 壮观霉素和 10 μg/ml 氨苄青霉素。

( 10 ) Plasmid Midi Kit (12143)  (Qiagen)。

2.3 文库的筛选

( 1 ) BL21 电转感受态细胞,先转化质粒 pREP4,再转化 pQE32△F(F [ 3 ] 代表 DHFR 片段 2)。

( 2 ) Genepulser™II electroporator system (BioRad) 或 electroporator 2510 (Eppendorf)。 

( 3 ) 槽宽 1 mm 的电转杯(Invitrogen )。

( 4 ) SOC 培养基 [见 15.2.2 (7)]。

( 5 ) PBS 缓冲液(1 L ): 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4,用 HCl 调 pH 至 7.4,高压灭菌。

( 6 ) 15.1 中所述合适抗生素的 M9 基本培养基(选择培养基)。1L : 740 ml 2.5% noble agar ( Difco)、200 ml 5X M9 盐(1L  M9 : 64 g Na2HPO4、15 g KH2PO4、2.5 g NaCl、5 g NH4Cl,参考文献 [43]),加入 2 ml 1 mol/L MgSO4、1 ml 100 mmol/L CaCl2 和 20% 葡萄糖。所有的盐和葡萄糖都是细胞培养级别,除了 100 μg/ml 氨苄青霉素、25 μg/ml 卡那霉素、1 mmol/L IPTG、10 μg/ml 甲氧苄氨嘧啶、800 μg/ml 酪蛋白水解物(casamino  acid)、10 μg/ml 硫胺素(thiamine)。所有溶液均须用去离子水配制并抽滤除菌或高压灭菌(抗生物、酪蛋白水解物、IPTG 和硫胺素 -20°C 保存,盐溶液室温存放)。注意 MgSO4、CaCl2 和葡萄糖溶液要分别灭菌。这种重组培养基被倒入直径为 100 mm 或 150 mm 的培养皿中,在 4°C 可存放 2 个月。

( 7 ) 质粒中提试剂盒(Qiagen) 或碱裂解的质粒大量提取。

( 8 ) 限制性内切核酸酶:Hpal、XmaI、EcoNI 和 XbaI ( NEB 或 Fermentas)。

( 9 ) XL-1 Blue 感受态细胞(chemiocompetent  cell ) ( 见 15.2.8)。

2.4 克隆竞争实验

( 1 ) 玻璃培养皿或 15 ml 锥形管(Coming )。

( 2 ) 固体和液体选择培养基 [ 与 15.2.3 ( 6 ) 相同,除液体培养基中不加琼脂 ] 。

( 3 ) Plasmid Midi Kit (Qiagen) 或 alkaline  lysis  maxiprep。

( 4 ) 含 100 μg/ml 氨苄青霉素和 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基。

2.5 克隆分离与测序

( 1 ) 限制性内切核酸酶:HpaI、XmaI、EcoNI 和 XbaI ( NEB 或 Fermentas)。

( 2 ) XL-1 Blue 感受态细胞。

( 3 ) 24 孔板(Corning) ,含 100 μg/ml 氨节青霉素的 LB 培养基。

( 4 ) 2 ml V-shape 96-well culture block  (VWR)。

( 5 ) Montage™ Plasmid Miniprep 96 kit ( Millipore,LSKP 09601 ) 或诸如 QIA-prep™ Spin  Miniprep kit (27104)  (Qiagen) 的小量纯化试剂盒,这取决于样品数量。

( 6 ) Vacuum manifold  Multiscreen  Resist™ ( Millipore,MAVM 096 OR)。

( 7 ) 质粒文库(IDT) 特异测序引物。

2.6 蛋白质纯化

( 1 ) 合适的限制性内切核酸酶(对这个例子是 SalI 和 XhoI)和连接所需试剂(见 15.2.2)。

( 2 ) BL21 pREP4 感受态细胞和含 100 μg/ml 氨芐青霉素和 25 μg/ml 卡那霉素的 LB 培养基。  

( 3 ) Terrific broth ( TB) 培养基(12 g 蛋白胨、24 g 酵母粉、4 ml 甘油、2.31 g KH2PO4 和 12.54 g K2HPO4,加水至 1 L ) 添加 100 μg/ml 氨苄青霉素和 25 μg/ml 卡那霉素。

( 4 ) 50 ml 锥形管。

( 5 ) 可以离心 96 孔板的离心机和转子,如 Eppendorf 5810 或 5810 R 和 A-4-62。

( 6 ) Ni-NTA Spin Kit 或 Ni-NTA Superflow™ 96  Biorobot  Kit (Qiagen),这取决于样品数量。我们使用下列较为便宜的产品替代 Superflow™ 96 Biorobot  Kit:  Ni-NTA Superflow  resin ( Qiagen)、0.25 mm 的 96 孔玻璃纤维过滤板(3510)、0.2 μm 的 96 孔 PVDF 膜板(3504)、 96 孔 volume  extender (3584) 和收集器(Corning)  (3958)。

( 7 ) Vacuum  manifold  Multiscreen  Resist™ 和一个大型收集器以及密封块(Milli­pore,MAVM 096 OR 和 OT)。

( 8 ) Buffer A:6 mol/L 盐酸胍、0.1 mol/L NaH2PO4、0.01 mol/L Tris-HCl,pH 8.0,添加 10 μmol/L 苯甲基磺酰氟、7.2 mmol/L β-巯基乙醇、15〜25 mmol/L 咪唑和 300 mmol/L NaCl。

( 9 ) Buffer B:同 Buffer A,但 pH 6.3,添加 7.2 mmol/L β-巯基乙醇,有时也添加 15 mmol/L 咪唑。

( 10 ) Buffer E :  4 mol/L 盐酸胍和 0.025 mol/L NaOAc pH 4.5。

( 11 ) DTT。

( 12 ) 6 mol/L KOH。

2.7 制备 SS320 和 BL21 pREP4  pQE-32  ras- F[3] 电转感受态细胞

( 1 ) SS320 和 BL21 pREP4  pQE-32 ras-F 的过夜培养物。

( 2 ) 500 ml SOB 培养基:2% 蛋白胨、0.5% 酵母粉、1 ml 10 mmol/L MaCl、2.5 mol/L KCl、10 mmol/L MgCl2 和 10 mmol/L MgSO4 和 0.2% 葡萄糖,用于 SS 320 菌株。

( 3 ) 500 ml 含有 0.2% 葡萄糖的 LB 培养基,用于 BL21 pREP4 菌株。

( 4 ) 2L 灭菌冰去离子水。

( 5 ) 10% 灭菌的甘油。

2.8 制备 XL-1 Blue 和 BL21  pREP 4 电转感受态细胞

( 1 ) XL-1 Blue 和  BL21 pREP4 过夜培养物。

( 2 ) 500 ml 含有 0.2% 葡萄糖的 SOB 培养基,用于 SS 320 菌株。

( 3 ) 500 ml 含有 0.2% 葡萄糖的 LB 培养基,用于 BL21 pREP4 菌株。

( 4 ) 转化缓冲液:10 mmol/L Pipes、15 mmol/L CaCl2、250 mmol/L KCl,用 KOH 调 pH 至 6.7,然后加入 MnCl2 至终浓度为 55 mmol/L。

( 5 ) Dimethylsulfoxide ( DMSO)。

4. 注

1. 在 PCR 之前,用 T4 多核苷酸激酶(polynucleotide  kinase ) 磷酸化引物使其可以进行连接反应。两个引物分别与被删区的两边配对。使用高保真的聚合酶,如 Pfu 或 Pfu Turbo , 进行 10~16 个循环的 PCR 反应。所得的 PCR 产物是不包含被删区的线性质粒。使 用 Dpnl 消化 PCR 产物,然后用乙醇沉淀,取 1/10 的 PCR 产物用于连接和转化,并筛选阳性克隆。插入移码是为了避免终止密码子被读通。PCR 方法来源于 ExSiteTM PCR 定向突变试剂盒(Stratagene) 。

2. 因为要扩增的序列很短,我们使用 Tag 聚合酶。若要扩增长基因,推荐使用高保真的聚合酶。如果 PCR 反 应 1 与 PCR 反应 2 产物的大小差异很大,特别是对于大的基因,推荐使用 mega-primer 方法 [ 50,51] 。这两个方法稍作改变,都可以用于构建序列中相距较远的区域同时变化的复合文库。

3. 将 Gelstar 稀释 104~105 倍用于 TAE 琼脂糖凝胶电泳,Gelstar 比 EB 更易分解,所以使用 Gelstar 须当天制胶。而且, Gelstar 信号在 DNA 浓度较低的条件下即饱和,所以高于一个浓度就很难定量 DNA 了。另外,Gelstar 对样品迁移速度也有较大影响,所以要注意每孔的上样量(一般来说,25 μl 的上样孔不要超过 300 ng 质粒 DNA) 。如果用 EB 染色也可以在蓝光下观察,但是若片段较小或是 PCR 产物则需要的样品量较多(线性质粒 DNA 要大于 1.5 μg)。当然也可以在紫外光下进行观察,但是要格外小心。

4. 同时构建几个文库时,更倾向于使用胶回收的方法,但是比较贵。也可以用 Dpn l  37°C 酶切 PCR 产物 2 h 以去除模板质粒 DNA,从而省去了 15.3.2 中第(3 ) 步的电泳切胶的步骤,然后 PCR 产物用 QIAquick 方法回收。

5. 这个量可以根据所研究基因的大小成比例增加。加入到 PCR 反应 3 中的 PCR 反应 1 和 2 产物的相对量可以根据它们的分子质量大小进行适当调节。

6. PCR 反应 3 的循环数要降到最小,否则会影响文库的重复性(图 15. 3 )。这一步值得优化以在最小循环数的条件下得到最大量的产物,我们推荐使用注 2 中提到的 Tag 聚合酶。

7. 这个载体是使用 Nde I 和 Xba l 消化 pQE-32 然后重新连接得到的,去除了终止子与复制子起点之间约 850 bp 的片段。根据我们的实验结果,蛋白质在这个新载体中的表达量和稳定性与之前一样,但是新载体的转化效率提高了一个数量级。而且,去除了原载体中位点,这样构建文库时就可以使用这个酶了。

8. 当使用的载体没有进行磷酸化修饰时,在此比例下得到的结果最好。

9. SS320 细胞是 MC1061 和 XL-1 B lue 细胞杂交得到的 [ 30 ]。将等体积 OD600 均为 0.6 的两种细胞混合,37°C 低转速(50 r/ min ) 培养 1 h,然后将转速升至 250 r/min 培养 5 min,终止结合。涂布添加了 10 μg/ml 四环素和壮观霉素的 LB 平板,分离新菌株。这个菌株不仅具有 MC1061 的高转化效率(大于 5X1010 菌落/μg 超螺旋质粒),并且也具有来源于 XL-1 Blue 的转化 PQE 载体所需的 Laclq 过量表达的性质。也可以用其他适用于给定表达系统的菌株。

10. 菌落计数并乘以稀释倍数。用 30 μl 水重悬 300 ng 的质粒,转化入 300 μl 的 SS 320 感受态细胞中,一 般可以得到 106~107 个菌落。

11. 我们最初选择 PQE 载体是因为我们希望可以在进行筛选和 Ni-NTA 亲和纯化过程之间无需更换载体。使用 PQE-32 衍生载体表达 ras-F[ 3 ] 融合蛋白 [31],虽然该质粒具有和 raf 的 RBD 文库相同的复制起点和抗生素选择标记,但是在三甲氧半二氨嘧啶的选择压力下两个质粒都不会丢失(如 mDHFR 的重构需要两个融合蛋白同时表达)。实际上我们构建了一个起始位点和抗性标记不同的 pQE-32 衍生质粒用来表达 ras 融合蛋白,但是使用该质粒大大降低了筛选的严密性,在这种条件下,基于序列信息,DHFR PCA 选出的克隆没有结合的能力。我们得到这个结论是因为,DHFR PCA 筛选所得克隆与结合的重要区域的序列中含有终止密码子和异常序列,说明这些相互作用是不特异的。这个问题可能可以通过在 F [ 3 ] 中插入不稳定突变 I114V 或 I114A 得以解决,但我们还没有检验。我们认为我们选择的方法严密性较高,因为在进行文库转化之前携带 pQE-32 ras-F [ 3 ] 的 BL21 pREP4 细胞有着 ColEl 复制起点的最高拷贝数,使携带的文库质粒拷贝数最小,这对细胞在选择培养基上生长是必要的。将来,可以使用低拷贝的表达诱饵蛋白的载体或 DHFR 不稳定突变。


12. 也可以直接将电转细胞加入 25 ml 的 M9 培养基中,这对直接开始竞争实验特别有用。

13. 观察发现,竞争实验前将细胞涂平板可以改善严密性,特别是在第一代,这意味着在固体培养基上生长可以加快最高克隆的选择效率。

14. 这个阶段我们推荐使用 QIAprep spin kit,因为用碱裂解法在 BL21 PREP4 中提的质粒质量不够好。另外,提质粒时用 QiagenPB  Buffer 洗 1 次柱子。

15. 第 2、第 3 步免去了测序前检查细胞中是否含有正确质粒的必要。本例中按此程序处理的 700 个菌落中含有pQE-32 ras-F[ 3 ] 或 pREP4 质粒。

16. PCR 反映 2 和 3 中所用的 3' 引物相同 [ 见 15.3.2 ( 5 ) ] 。

17. 建议体外检测蛋白质性质之前去除 DHFR 片段,除非特定的实验需要,因为它会减小产量,使提纯步骤更复杂,也有可能改变蛋白质性质。建议将蛋白质重新构建到不含 DHFR 片段的质粒中。为了实现这一目标,我们选用了兼容的酶切位点,用 XhoI 和 Sal 分别克隆文库和 F 片段 DNA [ 1,2] 。

18. 过夜饱和培养物 1 :10 稀释至含 100 μg/ml 氨苄青霉素的 TB 培养基中,37°C 300 r/min 培养 90 min,用 1 mmol/L 的 IPTG 诱导 4 h。然后每个克隆取出 60 μl,加入等体积 2X SDS- PAGE 上样缓冲液,电泳分析。可用考马斯亮蓝染色,或用抗 Histag 的抗体蛋白质印迹法检测蛋白质表达情况。

19. 在大规模提纯之前,建议测试几个克隆不同体积的产量。我们建议在变性条件下提纯蛋白质,是因为同时进行多个平行提纯时,它更易于操作。但是,如果蛋白质可溶性很好,也可以在非变性条件下提纯。本例中,表 达 raf  RBD 突变体的 25 ml 的 BL21 pREP4 细胞培养物,按 15.3.7 所述处理,可以得到 400 μl 浓度 200~600 μg/ml 的蛋白质。

20. 根据所需蛋白质的量或蛋白质表达水平,培养物体积可为 5~50 ml,详见注 19。

21. 蛋白质也可以 30°C 诱导表达过夜。

22. 除此之外,若用于分析的克隆量少,可以使用 Ni-NTA 旋转柱。如果需要独立克隆的较多蛋白质,可选择 Ni-NTA 琼脂糖柱纯化。本例中,在非变性条件下纯化是有用并合理的。

23. 所述系统仅适用于 Millipore 的大收集器和密封模块。离心前可以抽真空。

24. Millipore Manifold 中包含一个测量仪表 gauge。

25. 若需要,收集各漂洗步骤的穿出液和滤过液 [ 见 15.3.7 ( 9 ) 和(10 )]。

26. 本例中,蛋白质在变性条件下被洗脱,然后将样品稀释至变性剂浓度不会对蛋白质功能造成影响。需根据所研究蛋白质的稳定性来确定洗脱缓冲液中的变性剂浓度。但是,若要求在天然状态下洗脱蛋白质,Qiagen 推荐使用浓度梯度递减的盐酸胍。这样用合适的缓冲液洗脱出的蛋白质中就不含变性剂了。当然也可以在非变性条件下提纯蛋白质(见 Qiagen Expressionist and Ni-NTA spin column handbook)。我们使用 25 mmol/L 或 50 mmol/L 的乙酸缓冲液(pH 5.0 ) 改善洗脱效率(见注 27,洗脱后适当调节 pH )。本研究中,合适浓度的尿素也可以用作变性剂。另外,因为尿素在用氰酸盐平衡的溶液中,使用时应小心。但是,高浓度的尿素也不会沉淀SDS,所以每一步纯化所得的样品都可以用于 SDS-PAGE 分析。

27. 洗脱后在样品中加入 DDT 是因为 Ni-NTA 不推荐使用 DDT。可以再 NaOH 或其他合适弱碱,如 Tris 或 NaOAc,调节洗出液 pH。

28. 如果样品不是立即用于性质鉴定,我们建议在样品中加入 40% ( V/V ) 的甘油和 1 mmol/L NaN3,-20℃ 保存。在性质鉴定前通过透析或超滤去除甘油。或者,不加甘油,用液氮速冻样品,-80°C 保存。

29. 根据 QIAEXpressionnist Handbook,用 TFB 缓冲液(RbCl ) 制作的 BL21 PREP4 感受态细胞效价更高,但是由于我们仅用该细胞转化超螺旋 DNA,用 Inoue 方法制作感受态细胞即可 [48]。

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