Raf 蛋白 Ras 结合结构域的简并进化库合成以及利用片段互补法快速筛选二氢叶酸还原酶的快速折叠且稳定的克隆
丁香园
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1. 引言
随着 20 世纪七八十年代重组 DNA 技术的出现，已发展出大量的合成和筛选寡核苷酸文库的新方法，用于研究和了解是哪些序列编码了具有期望特性的新蛋白质，这些特性包括在特定条件下酶的活性、结合力以及蛋白质的稳定性 [ 1〜8 ] 。对于任何一个给定的例子，要进行此类蛋白质的工程研究，必须具备两个条件：构建多样化序列文库的策略和从文库中筛选具有特定性质产物的有效方法。其中，选择何种方法合成文库至关重要，因为这决定了文库能否提供大量充足的筛选空间，从而最大限度的为得到编码蛋白质特定性质的序列提供最多的选择。因此，发展构建文库的策略毫无疑问一直是这个领域的研究焦点。过去的文献，报道了一些将蛋白质中的某区域完全随机化或高度简并化的例子，以回答关于蛋白质折叠的问题 [ 9，10 ]。然而，关于真正建立高度简并文库，寻找编码新的折叠、结合能力或酶活的序列的报道仍很少见 [ 6，11] 。构建高度随机文库固有的以及随后在大量时序列库中寻找编码特定性质的少数序列的局限性，推进了新方法的设计和开发，这其中就包括 DNA 混编（DNA shuffling ) 策略或允许毫无序列相似性的基因间重组的新方法 [ 12〜18] 。
如果没有适当的筛选策略，即使文库设计得再精巧也无法得到有用的产物。例如，在一个文库中筛选编码具有特定酶活、稳定性或结合靶标蛋白能力的蛋白质的理想方法是，在某细胞或有机体中表达该文库，而库中具有所需性质的成员可以在特定的条件或基因背景下，在特定的选择培养基中生长[1，19〜22 ]。但是，这种例子是极为
少见的，所以从事蛋白质工程研究的人员一直在寻求可以更为普遍应用的文库筛选方法 [ 23〜26 ]。更具体地说，结合检测经常可以用于在一个 DNA 文库中筛选表达正确折叠的、稳定的和可以与其他分子（蛋白质、核酸、有机底物、过渡态类似物等）结合的多肽。目前建立的最完善的方法是噬菌体展示 [4，5，27]；综述 [ 28 〜30 ]，该方法将文库的扩增和筛选分开，分别在体内和体外进行，适用于与可以容易地固定在固体介质上的小分子或小肽结合的蛋白质，但不太适用于蛋白质与蛋白质相互作用研究或文库间筛选。近来，蛋白质片段互补检测（PCA) 成为一个替代选择 [ 31〜34 ] 。PCA 的策略是，将两个蛋白质分别与报告蛋白或酶的两个片段融合表达，两个目的蛋白的结合将报告蛋白的两个片段连在一起，从而使报告蛋白具有可以检测的功能。例如，以鼠二氢叶酸还原酶（mDHFR) 作为报告蛋白，在大肠杆菌中利用简单的存活选择实验进行文库筛选的方法已经建立起来[ 32] 。与在所有的原核和真核细胞中相同，在大肠杆菌中，DHFR 的产物四氢叶酸是合成胸腺嘧啶、甘氨酸、丝氨酸和腺嘌呤所必需的，在原核生物中，它还是合成泛酸所必需的。因此，在不提供 DHFR 终产物的条件下，DHFR 的活性显然对于细胞生长和分裂是不可缺少的。用甲氧苄氨嘧啶（trim ethop rim，叶酸类似物，
其抑制大肠杆菌 DHFR 的能力是抑制哺乳动物 DHFR 的 12000 倍）处理的大肠杆菌的生长依赖于重组 mDHFR 的表达 [ 35 ] 。这样，将两个目的蛋白分别与 DHFR 的两个片段融合并共表达，如果两个蛋白质之间有相互作用，则大肠杆菌可以在添加了甲氧苄氨嘧啶的基本培养基上生长 [31]。在一个最初的文库间筛选中，DHFRPCA 被用于从含有 6 X1010 个可能结合的序列的单独文库中鉴定出可以形成最优的形成亮氨酸拉链的异源二聚体序列。竞争实验（competition experiment) 和 “文库混编” （library shuffling) 策略旨在改善文库筛选的覆盖范围 ，进一步优化形成二聚体的蛋白质对，并最终找到一个 “成功的蛋白质对” [ 32，36] 。近来，DHFR PCA 经修改用于在体内筛选单链抗体 [37]。DHFR PCA 策略将基因筛选整合的方法，是可以简化文库间筛选的关键，因为在若干的循环中选择压力同时施加于两个文库上，从而避免了如噬菌体展示技术那样将文库扩增和筛选分开进行，这使 DHFR PCA 真正可以用来研究寡聚体序列的同时进化。
亮氨酸拉链例子的结果使我们相信 DHFR PCA 可以用于解决更具挑战性的问题。在此例中，仅仅改变了几个关键氨基酸的位置，而且只有 2〜4 个氨基酸可以被替换。基于之前的理论研究 [38]，我们试图严格并全面的测定使 Ser/Thr 蛋白激酶 raf 的 ras 结合结构域（RBD) 正确折叠的序列决定因素同之前发表噬菌体展示策略类似，我们所用方法的目标是鉴定出蛋白质折叠和稳定所必需的序列 [40]。其原理是：如果一个给定的 RBD 变体可以快速正确的折叠并足够稳定，那么它应该可以与 ras 相互作用。将 RBD 文库和 ras 分别与 DHFR 两个互补的片段融合并在大肠杆菌中共表达，在本节上述的选择压力下，RBD 文库中可以快速折叠的稳定成员将与 ras 相互作用，使 DHFR 恢复活性从而使得大肠杆菌可以生长。我们选择了一个高效且现实可行的方法设计文库，最大限度的开发了其序列多样性并将文库限定在合理的大小。基于此研究提出的问题，一个有意义的扩展序列筛选空间的方法是，在构建文库时每次只改变一小段连续的氨基酸残基 [ 10 ]。经过对 RBD 结构的研究，我们发现可以将其分割成 13 个区域，分别对应多个独立的 β 转角或环、β 链和一个 α 螺旋（我们构建了两个文库，分别对应该区域的 N 端和 C 端），其长度为 4〜8 个残基 [41，42] 。以此为依据，我们构建了 13 个简并进化库，用 NNK ( 其中 N 表示任何核苷酸，K 表示 G 或 T ) 取代野生型蛋白的密码子，这就使得 20 种氨基酸中的任何一种都可以插入到每个可变区。然后，在大肠杆菌中利用 DHFR PCA 筛选这些文库中可以与 ras 结合的成员。除了筛选可以完全在体内进行，该方法最大的优点是得到的文库中可以与 ras 相互作用的成员无需更换表达系统
即可用于纯化和生理分析。
基于在设计和合成文库以及用 DHFR PCA 对文库进行筛选过程中遇到的技术挑战，在此我们介绍了实验方法和问题解决策略。希望这些方法足够全面，不仅对对折叠有兴趣的人有用，而且对解决优化蛋白质之间的相互作用的问题也有帮助。
随着 20 世纪七八十年代重组 DNA 技术的出现，已发展出大量的合成和筛选寡核苷酸文库的新方法，用于研究和了解是哪些序列编码了具有期望特性的新蛋白质，这些特性包括在特定条件下酶的活性、结合力以及蛋白质的稳定性 [ 1〜8 ] 。对于任何一个给定的例子，要进行此类蛋白质的工程研究，必须具备两个条件：构建多样化序列文库的策略和从文库中筛选具有特定性质产物的有效方法。其中，选择何种方法合成文库至关重要，因为这决定了文库能否提供大量充足的筛选空间，从而最大限度的为得到编码蛋白质特定性质的序列提供最多的选择。因此，发展构建文库的策略毫无疑问一直是这个领域的研究焦点。过去的文献，报道了一些将蛋白质中的某区域完全随机化或高度简并化的例子，以回答关于蛋白质折叠的问题 [ 9，10 ]。然而，关于真正建立高度简并文库，寻找编码新的折叠、结合能力或酶活的序列的报道仍很少见 [ 6，11] 。构建高度随机文库固有的以及随后在大量时序列库中寻找编码特定性质的少数序列的局限性，推进了新方法的设计和开发，这其中就包括 DNA 混编（DNA shuffling ) 策略或允许毫无序列相似性的基因间重组的新方法 [ 12〜18] 。
如果没有适当的筛选策略，即使文库设计得再精巧也无法得到有用的产物。例如，在一个文库中筛选编码具有特定酶活、稳定性或结合靶标蛋白能力的蛋白质的理想方法是，在某细胞或有机体中表达该文库，而库中具有所需性质的成员可以在特定的条件或基因背景下，在特定的选择培养基中生长[1，19〜22 ]。但是，这种例子是极为
少见的，所以从事蛋白质工程研究的人员一直在寻求可以更为普遍应用的文库筛选方法 [ 23〜26 ]。更具体地说，结合检测经常可以用于在一个 DNA 文库中筛选表达正确折叠的、稳定的和可以与其他分子（蛋白质、核酸、有机底物、过渡态类似物等）结合的多肽。目前建立的最完善的方法是噬菌体展示 [4，5，27]；综述 [ 28 〜30 ]，该方法将文库的扩增和筛选分开，分别在体内和体外进行，适用于与可以容易地固定在固体介质上的小分子或小肽结合的蛋白质，但不太适用于蛋白质与蛋白质相互作用研究或文库间筛选。近来，蛋白质片段互补检测（PCA) 成为一个替代选择 [ 31〜34 ] 。PCA 的策略是，将两个蛋白质分别与报告蛋白或酶的两个片段融合表达，两个目的蛋白的结合将报告蛋白的两个片段连在一起，从而使报告蛋白具有可以检测的功能。例如，以鼠二氢叶酸还原酶（mDHFR) 作为报告蛋白，在大肠杆菌中利用简单的存活选择实验进行文库筛选的方法已经建立起来[ 32] 。与在所有的原核和真核细胞中相同，在大肠杆菌中，DHFR 的产物四氢叶酸是合成胸腺嘧啶、甘氨酸、丝氨酸和腺嘌呤所必需的，在原核生物中，它还是合成泛酸所必需的。因此，在不提供 DHFR 终产物的条件下，DHFR 的活性显然对于细胞生长和分裂是不可缺少的。用甲氧苄氨嘧啶（trim ethop rim，叶酸类似物，
其抑制大肠杆菌 DHFR 的能力是抑制哺乳动物 DHFR 的 12000 倍）处理的大肠杆菌的生长依赖于重组 mDHFR 的表达 [ 35 ] 。这样，将两个目的蛋白分别与 DHFR 的两个片段融合并共表达，如果两个蛋白质之间有相互作用，则大肠杆菌可以在添加了甲氧苄氨嘧啶的基本培养基上生长 [31]。在一个最初的文库间筛选中，DHFRPCA 被用于从含有 6 X1010 个可能结合的序列的单独文库中鉴定出可以形成最优的形成亮氨酸拉链的异源二聚体序列。竞争实验（competition experiment) 和 “文库混编” （library shuffling) 策略旨在改善文库筛选的覆盖范围 ，进一步优化形成二聚体的蛋白质对，并最终找到一个 “成功的蛋白质对” [ 32，36] 。近来，DHFR PCA 经修改用于在体内筛选单链抗体 [37]。DHFR PCA 策略将基因筛选整合的方法，是可以简化文库间筛选的关键，因为在若干的循环中选择压力同时施加于两个文库上，从而避免了如噬菌体展示技术那样将文库扩增和筛选分开进行，这使 DHFR PCA 真正可以用来研究寡聚体序列的同时进化。
亮氨酸拉链例子的结果使我们相信 DHFR PCA 可以用于解决更具挑战性的问题。在此例中，仅仅改变了几个关键氨基酸的位置，而且只有 2〜4 个氨基酸可以被替换。基于之前的理论研究 [38]，我们试图严格并全面的测定使 Ser/Thr 蛋白激酶 raf 的 ras 结合结构域（RBD) 正确折叠的序列决定因素同之前发表噬菌体展示策略类似，我们所用方法的目标是鉴定出蛋白质折叠和稳定所必需的序列 [40]。其原理是：如果一个给定的 RBD 变体可以快速正确的折叠并足够稳定，那么它应该可以与 ras 相互作用。将 RBD 文库和 ras 分别与 DHFR 两个互补的片段融合并在大肠杆菌中共表达，在本节上述的选择压力下，RBD 文库中可以快速折叠的稳定成员将与 ras 相互作用，使 DHFR 恢复活性从而使得大肠杆菌可以生长。我们选择了一个高效且现实可行的方法设计文库，最大限度的开发了其序列多样性并将文库限定在合理的大小。基于此研究提出的问题，一个有意义的扩展序列筛选空间的方法是，在构建文库时每次只改变一小段连续的氨基酸残基 [ 10 ]。经过对 RBD 结构的研究，我们发现可以将其分割成 13 个区域，分别对应多个独立的 β 转角或环、β 链和一个 α 螺旋（我们构建了两个文库，分别对应该区域的 N 端和 C 端），其长度为 4〜8 个残基 [41，42] 。以此为依据，我们构建了 13 个简并进化库，用 NNK ( 其中 N 表示任何核苷酸，K 表示 G 或 T ) 取代野生型蛋白的密码子，这就使得 20 种氨基酸中的任何一种都可以插入到每个可变区。然后，在大肠杆菌中利用 DHFR PCA 筛选这些文库中可以与 ras 结合的成员。除了筛选可以完全在体内进行，该方法最大的优点是得到的文库中可以与 ras 相互作用的成员无需更换表达系统
即可用于纯化和生理分析。
基于在设计和合成文库以及用 DHFR PCA 对文库进行筛选过程中遇到的技术挑战，在此我们介绍了实验方法和问题解决策略。希望这些方法足够全面，不仅对对折叠有兴趣的人有用，而且对解决优化蛋白质之间的相互作用的问题也有帮助。
