玻璃奶法快速纯化回收DNA片段

本方法有多种用途，主要包括：

从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段；

从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段；

从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）；

DNA浓缩、去盐及去除杂质。

本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀作用的白色颗粒，能专一性结合0.2kb到50kb大小的DNA（双链或单链，线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。

一、使用本法回收DNA片段有以下优点：

高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等；

简便：所需主要仪器是一架台式离心机；

快速：整个回收过程只需半个小时；

高效：回收得率达到70%以上；

多用途：可以同时作胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等；

安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。

二、试剂盒组成

1．碘化钠溶液： 50ml

2．DNA洗涤液（20倍浓缩液）：10ml

3．“基因纯”试剂： 1ml

4．超纯水： 1ml

使用前，将DNA洗涤浓缩液（10ml）倒入一玻璃瓶中，加140ml无水乙醇及50ml蒸馏水（由使用者自配），混匀后置于-20℃冰箱中，其余溶液置于4℃冰箱。

三、操作步骤

从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段

a. 常规DNA电泳。按常规方法用溴化乙锭（EB）染色DNA，而后将欲分离的DNA带从胶上切割下来，置于一1.5ml离心管中。

b. 称出凝胶带的重量，加入三倍量（V/W）的碘化钠溶液。（如0.1g凝胶中加入0.3ml碘化钠溶液）。

c. 置于55℃水浴5-10分钟，直至凝胶完全溶化。

d. 加入20μl充分混匀的“基因纯”试剂（建议使用前用漩涡振荡器振荡3分钟），室温放置5分钟（期间不时将管子颠倒几次以混匀）。

e. 离心10秒（10,000rpm），倒去上清液。

f. 加0.8ml刚从冰箱中取出的DNA洗涤液，充分摇匀，离心10秒，去上清。

g. 重复步骤f两次（共洗涤三次）。

h. 用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。

i. 加入20μl超纯水，混匀后置于55℃水浴5分钟。

j. 离心3分钟，将上清液小心吸至另一个离心管，即为纯化的DNA。可直接用于酶切、亚克隆、PCR、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。

注意事项：

溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。

DNA洗涤液应保持在低温，否则可能使DNA从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。

步骤h是另一关键，管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去，可能导致“基因纯”试剂上结合的DNA无法由蒸馏水洗脱。

PCR反应物中纯化目的DNA片段

PCR反应完毕后，加蒸馏水至100μl（最后体积）。

加入300μl碘化钠溶液，混匀。

以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。

从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的DNA片段

探针制备反应完毕后，加蒸馏水至100μl（最后体积）。

加入300μl碘化钠溶液，混匀。

以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。

DNA浓缩，去盐及去除杂质

加入3倍量的碘化钠溶液于样品DNA溶液中（若DNA为固态，则先将之溶于适量水或TE中，再加3倍体积的碘化钠溶液）。

加20μl或更多的“基因纯”试剂（每μl该试剂可吸附0.3ugDNA，操作者可根据这一指标自行决定“基因纯”试剂的用量，但不应少于10μl）。

以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段”中步骤d到j相同。