紫花苜蓿茎细胞壁蛋白质提取
丁香园
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1. 前言
正如所有的亚细胞的蛋白质组学研究，提取细胞壁蛋白质组的关键因素是提取的蛋白质片段不能被来自细胞其他部位的蛋白质污染。通常情况下用两种方法来分离细胞壁的蛋白质。非破裂和破裂蛋白质提取两种方法各自有其优缺点，特别是有关蛋白质污染和改进当前的提取方法。第二个重要方面是多糖多酸类污染物的清除，它们在双向电泳中产生不良作用。过去，细胞培养为细胞壁蛋白质的提取提供了均一并且相对「 干净」的组织来源。虽然分化的组织在生物学研究上相关性更强，但是研究起来更加复杂和困难 ，目前对于这些组织的大规模的蛋白质组的成果相对比较新。本章简单总结现有细胞壁蛋白质提取方法并且描述一种从紫花苜蓿茎中提取细胞壁蛋白质的具体方法。
提取细胞壁蛋白质最古老和温和的方法可能包括在适当的溶液悬浮或者洗涤直接从完整的培养细胞提取。史密斯等 [1] 把番茄的悬浮细胞用 CaCl2 浓度梯度洗涤出伸展蛋白的前体流入小柱子。Scott 和 O'Neil [2] 从胡萝卜悬浮细胞中通过用不同浓度的含有 CaCl2、Triton X-100 和 0.1 mol/L LiCl 的溶液提取胞外蛋白。在 0.1% Triton X-100 或 0.1 mol/L CaCl2 中萃取后的悬浮细胞可以再重新回到同样的培养液中生长。
从 5 种植物体中提取只含有初生细胞壁的蛋白质 [3] 是分离和鉴定大量细胞壁蛋白质的尝试之一。通过过滤收集细胞，通过在 5 种不同的缓冲液中搅拌细胞提取蛋白质。缓冲液包含 0.2 mol/L CaCl2、50 mmol/L CTA、50 mmol/L 乙酸钠（pH 6. 5)、2 mmol/L 的二硫苏糖醇、1 mol/L NaCl 和 0.2 mol/L 硼酸，pH 7.5，缓冲液用于后续和非后续的提取体系。Blee 等 [4] 采用了同时具有初生细胞壁和次生细胞壁的转化了的烟草的悬浮细胞系作为活细胞直接提取总蛋白的来源。蛋白质提取用 0.2 mol/L CaCl2、50 mmol/L CDTA。
这个方法的改进后则是用真空透析的原生质体 [ 5 ] 或整个植物组织 [ 6，7] 来洗涤非原生质体和细胞壁的蛋白质。这个方法包括一个灌输步骤借助盐溶液或其他的溶液通过温和降低压力从而进入细胞间隙。 Roger 等 [ 5 ] 用 1 mol/L NaCl 和 0.4 mol/L CaCl2 来透析来自于纤维植物下胚轴的固定原生质体，并通过离心和过滤收集非原生质体。马铃薯块茎中的非原生质体通过含有 0.6 mol/L 的 NaCl 透析组织获得，然后，离心收集提取物 [6]) ，已使用这种方法收集叶片中的汁液，这种方法采用含 20 mmol/L 抗坏血酸、20 mmol/L 氯化钙 [7] 的溶液。根汁液收集通过简单切割和离心组织收获分泌物 [8]。
非破坏性蛋白质提取方法的一个主要的缺点是，细胞壁蛋白质的产量通常较低。目前以基因组为基础的估算预测出数以百计的分泌蛋白 [9]；然而只有这个数量的一小部分 ，在没有破坏的植物细胞壁的蛋白质研究中被发现。第二个缺点是质膜断裂的可能性将导致伴随细胞质和膜蛋白的细胞壁组分的污染。由于污染是一个巨大的障碍，因此确保细胞壁的纯度的方法应包括针对典型的污染蛋白质如检测标记酶的活性或 Western 杂交。
另一种从活细胞中洗脱细胞壁的蛋白质的方法是利用质膜的质壁分离使质膜萎缩脱离细胞壁。Borderies 等 [10] 用活拟南芥悬浮培养细胞来提取细胞壁松散结合的蛋白质。培养物首先用 50% 甘油质壁分离，然后相继用不同的缓冲液提取。利用两种不同的提取体系—— NaCl、EDTA、0.2 mol/L CaCl2 或 NaCl、EDTA、2 mol/L LiCl 来优化方法并且减少提取处理所造成的膜渗透的问题。这些处理中的几个导致细胞壁蛋白污染上胞内蛋白，因此要利用透射电子显微镜来验证质膜的完整性。
破坏性蛋白质提取的方法是细胞壁蛋白提取的第二个主要途径，并且这个方法也应用了质壁分离。在用含有甘油和甘露醇的溶液处理拟南芥的悬浮细胞系后，将细胞通过一个 N2 破碎弹（disruption bomb) [11]) 。随后细胞碎片被恢复并且通过显微镜检查。从准备的细胞壁材料中用 2% 的十二烷基硫酸钠（SDS ) 提取蛋白质并用 Western 杂交分析污染的胞内蛋白。作为非破坏性的方法，污染是一个重大的问题，因此必须保证细胞壁的纯度。
在同一组发表的两篇文献中拟南芥悬浮细胞的匀浆液也被用来作为一个细胞壁蛋白质的来源 [ 12，13] 。在这两种情况下，细胞洗涤、过滤，并通过细胞破坏器。这些匀浆在甘油溶液中被分层并且通过重力沉淀后细胞壁组分被收集和洗涤。纯化的细胞壁由电子显微镜检查并且通过免疫荧光和免疫杂交检测污染的胞内或膜蛋白 [12] 。结果支持了作者的结论：细胞壁组分没有污染的蛋白质。在这两个文件中，细胞壁组分中的蛋白质先用 0.2 mol/L 氯化钙提取然后用尿素缓冲液。
已经从挪威云杉木质部悬浮培养的活细胞中提取了细胞壁的蛋白质 [14]。通过在 1 mol/L 氯化钠的缓冲液中孵育的方法将细胞壁蛋白质从经过过滤和洗涤的细胞中洗脱下来。分离的细胞进行匀浆，随之蛋白质被释放，但在离子作用下又与细胞壁结合，用 1 mol/L Nace 缓冲液进行提取洗脱以去除蛋白质得到完整的细胞壁。这些细胞壁经过分离、洗涤、匀浆并悬浮在提取缓冲液中。细胞壁经过冷冻干燥并且用混合纤维素酶/浸解酶处理来消化细胞壁，从而释放共价结合的细胞壁蛋白质。
传统上，从植物组织的细胞壁中提取的混合蛋白质用来分离单一蛋白质或某类特有蛋白质。举例来说，0.2 mol/L 氯化钙被用来从大豆种子的种皮提取富含羟脯氨酸的细胞壁糖蛋白（HPRG )[ 15 ] 。同样，从大豆幼苗中分离出了 HPRG [16] 。细胞壁蛋白质用 10% 三氯乙酸（TCA ) 沉淀后，在余下的上清液中检测到了蛋白质。McQueen-Mason 等从黄瓜幼苗的盐溶性细胞壁蛋白质中纯化出了与延伸相关的细胞壁蛋白质 [ 17] 。McDougall [18] 用一个单一的木质部，从云杉压缩和未压缩的木材枝条细胞壁中分离出了差异表达的氧化酶。
在分化的植物组织中不常大规模开展细胞壁蛋白质组学研究，主要是由于蛋白质、多糖、多酚类污染物造成的局限性，本章描述的这种方法可用于大规模进行细胞壁蛋白质组学研究和在实验中总结的解决蛋白质污染的途径和经验（见注释）。详 见 http ://cellwall.genomics.purdue .edu。该方法涉及细胞破碎，一系列的严格的清洗，以消除污染蛋白质，并且用氯化钙和氯化锂提取细胞壁蛋白质。为确保纯度实验步骤用 Bradford 实验和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ) 凝胶检测。用一个清除试剂盒处理后 ，纯化后的蛋白质就可以准备用于双向电泳分离。用这种方法从木质化紫花苜蓿（紫花苜蓿）茎细胞壁中分离得到了大量重复的各式各样蛋白质。这种方法减少了干扰一向和二向电泳的多糖和多酚物质，使得蛋白质准备样品中污染很少含有数只百计的蛋白质数量。蛋白质点可以很容易通过基质辅助激光解吸离子化 - 飞行时间质谱（MALDITOF MS ) 或液相色谱（LC ) /MS/MS 的方法得到鉴定 [19] 。
该方法的一个缺点是明显地缺少一些往往在其他类型的细胞壁材料中能够检测到的蛋白质。这些包括高度糖基化蛋白和质膜蛋白（PM ) 。这些糖基化蛋白比其他细胞壁蛋白更易溶因此可能会在去除胞浆蛋白时的严格清洗而丢失 [ 19] 。质膜蛋白并不像其他蛋白质那样紧密结合细胞壁因此在严格的清洗条件下也同样丢失。这些蛋白质可以通过双向电泳浓缩和分离，也可以用补充的非破坏性的技术来分离它们。像其他细胞壁蛋白质的提取方法一样，此方法的要求是确保细胞壁都是无污染的。洗涤后需 要用 SDSPAGE 或免疫杂交对标志性的酶进行检测以确定蛋白质提取物的纯度。
在此方法中选择的提取用盐溶液已被普遍用来洗脱细胞壁的蛋白质。通过离子交换 ，氯化钙与结合蛋白质进行交换使细胞壁蛋白释放出来 [1] ，它的交换能力比氯化钠更有效率，与 0.1% Triton X-100 相比，氯化钙能够从活体培养的细胞壁中释放更多的蛋白质 [2] ，并且广泛应用于从植物细胞壁中提取细胞壁蛋白质 [ 1~5，7，10，12，13，16，18，19] 。众所周知膜的完整性会被 0.2 mol/L 氯化钙破坏 [ 10 ] ；因此，我们选择了用 0.2 mol/L CaCl2 从破碎的组织中提取细胞壁蛋白质。
本章介绍的方法还利用了氯化锂，一种常用的细胞壁蛋白萃取剂 [ 10，20，21] 。Voight 用不等浓度的 LiCl ( 0.1~8 mol/L ) 处理衣藻细胞并且发现从所有细胞周期阶段提取细胞壁蛋白质的最佳浓度是 2~4 mol/L，超过 4 mol/L LiCl 不会提取出更多的蛋白质。随着 LiCl 浓度的增加，更多的碳水化合物也伴随着蛋白质被提取出来。我们的方法在提取中使用 3 mol/L LiCl 来提取更多量的不含有额外共萃取碳水化合物的蛋白质。
虽然使用这种方法得到的分离洗前的细胞壁蛋白质用 SDS-PAGE 和免疫印迹检测似乎是干净的，但是只有约 50% 鉴定蛋白质有一个信号肽。与其他细胞壁蛋白的蛋白质组学研究相比，经典分泌蛋白所占比例似乎是合理的 [10，12] 并且可能反映了从一个没有膜包围的细胞器中纯化其中蛋白质固有存在的困难。它也可能暗示了蛋白质分泌的非经典途径 [ 23，24] 。
正如所有的亚细胞的蛋白质组学研究，提取细胞壁蛋白质组的关键因素是提取的蛋白质片段不能被来自细胞其他部位的蛋白质污染。通常情况下用两种方法来分离细胞壁的蛋白质。非破裂和破裂蛋白质提取两种方法各自有其优缺点，特别是有关蛋白质污染和改进当前的提取方法。第二个重要方面是多糖多酸类污染物的清除，它们在双向电泳中产生不良作用。过去，细胞培养为细胞壁蛋白质的提取提供了均一并且相对「 干净」的组织来源。虽然分化的组织在生物学研究上相关性更强，但是研究起来更加复杂和困难 ，目前对于这些组织的大规模的蛋白质组的成果相对比较新。本章简单总结现有细胞壁蛋白质提取方法并且描述一种从紫花苜蓿茎中提取细胞壁蛋白质的具体方法。
提取细胞壁蛋白质最古老和温和的方法可能包括在适当的溶液悬浮或者洗涤直接从完整的培养细胞提取。史密斯等 [1] 把番茄的悬浮细胞用 CaCl2 浓度梯度洗涤出伸展蛋白的前体流入小柱子。Scott 和 O'Neil [2] 从胡萝卜悬浮细胞中通过用不同浓度的含有 CaCl2、Triton X-100 和 0.1 mol/L LiCl 的溶液提取胞外蛋白。在 0.1% Triton X-100 或 0.1 mol/L CaCl2 中萃取后的悬浮细胞可以再重新回到同样的培养液中生长。
从 5 种植物体中提取只含有初生细胞壁的蛋白质 [3] 是分离和鉴定大量细胞壁蛋白质的尝试之一。通过过滤收集细胞，通过在 5 种不同的缓冲液中搅拌细胞提取蛋白质。缓冲液包含 0.2 mol/L CaCl2、50 mmol/L CTA、50 mmol/L 乙酸钠（pH 6. 5)、2 mmol/L 的二硫苏糖醇、1 mol/L NaCl 和 0.2 mol/L 硼酸，pH 7.5，缓冲液用于后续和非后续的提取体系。Blee 等 [4] 采用了同时具有初生细胞壁和次生细胞壁的转化了的烟草的悬浮细胞系作为活细胞直接提取总蛋白的来源。蛋白质提取用 0.2 mol/L CaCl2、50 mmol/L CDTA。
这个方法的改进后则是用真空透析的原生质体 [ 5 ] 或整个植物组织 [ 6，7] 来洗涤非原生质体和细胞壁的蛋白质。这个方法包括一个灌输步骤借助盐溶液或其他的溶液通过温和降低压力从而进入细胞间隙。 Roger 等 [ 5 ] 用 1 mol/L NaCl 和 0.4 mol/L CaCl2 来透析来自于纤维植物下胚轴的固定原生质体，并通过离心和过滤收集非原生质体。马铃薯块茎中的非原生质体通过含有 0.6 mol/L 的 NaCl 透析组织获得，然后，离心收集提取物 [6]) ，已使用这种方法收集叶片中的汁液，这种方法采用含 20 mmol/L 抗坏血酸、20 mmol/L 氯化钙 [7] 的溶液。根汁液收集通过简单切割和离心组织收获分泌物 [8]。
非破坏性蛋白质提取方法的一个主要的缺点是，细胞壁蛋白质的产量通常较低。目前以基因组为基础的估算预测出数以百计的分泌蛋白 [9]；然而只有这个数量的一小部分 ，在没有破坏的植物细胞壁的蛋白质研究中被发现。第二个缺点是质膜断裂的可能性将导致伴随细胞质和膜蛋白的细胞壁组分的污染。由于污染是一个巨大的障碍，因此确保细胞壁的纯度的方法应包括针对典型的污染蛋白质如检测标记酶的活性或 Western 杂交。
另一种从活细胞中洗脱细胞壁的蛋白质的方法是利用质膜的质壁分离使质膜萎缩脱离细胞壁。Borderies 等 [10] 用活拟南芥悬浮培养细胞来提取细胞壁松散结合的蛋白质。培养物首先用 50% 甘油质壁分离，然后相继用不同的缓冲液提取。利用两种不同的提取体系—— NaCl、EDTA、0.2 mol/L CaCl2 或 NaCl、EDTA、2 mol/L LiCl 来优化方法并且减少提取处理所造成的膜渗透的问题。这些处理中的几个导致细胞壁蛋白污染上胞内蛋白，因此要利用透射电子显微镜来验证质膜的完整性。
破坏性蛋白质提取的方法是细胞壁蛋白提取的第二个主要途径，并且这个方法也应用了质壁分离。在用含有甘油和甘露醇的溶液处理拟南芥的悬浮细胞系后，将细胞通过一个 N2 破碎弹（disruption bomb) [11]) 。随后细胞碎片被恢复并且通过显微镜检查。从准备的细胞壁材料中用 2% 的十二烷基硫酸钠（SDS ) 提取蛋白质并用 Western 杂交分析污染的胞内蛋白。作为非破坏性的方法，污染是一个重大的问题，因此必须保证细胞壁的纯度。
在同一组发表的两篇文献中拟南芥悬浮细胞的匀浆液也被用来作为一个细胞壁蛋白质的来源 [ 12，13] 。在这两种情况下，细胞洗涤、过滤，并通过细胞破坏器。这些匀浆在甘油溶液中被分层并且通过重力沉淀后细胞壁组分被收集和洗涤。纯化的细胞壁由电子显微镜检查并且通过免疫荧光和免疫杂交检测污染的胞内或膜蛋白 [12] 。结果支持了作者的结论：细胞壁组分没有污染的蛋白质。在这两个文件中，细胞壁组分中的蛋白质先用 0.2 mol/L 氯化钙提取然后用尿素缓冲液。
已经从挪威云杉木质部悬浮培养的活细胞中提取了细胞壁的蛋白质 [14]。通过在 1 mol/L 氯化钠的缓冲液中孵育的方法将细胞壁蛋白质从经过过滤和洗涤的细胞中洗脱下来。分离的细胞进行匀浆，随之蛋白质被释放，但在离子作用下又与细胞壁结合，用 1 mol/L Nace 缓冲液进行提取洗脱以去除蛋白质得到完整的细胞壁。这些细胞壁经过分离、洗涤、匀浆并悬浮在提取缓冲液中。细胞壁经过冷冻干燥并且用混合纤维素酶/浸解酶处理来消化细胞壁，从而释放共价结合的细胞壁蛋白质。
传统上，从植物组织的细胞壁中提取的混合蛋白质用来分离单一蛋白质或某类特有蛋白质。举例来说，0.2 mol/L 氯化钙被用来从大豆种子的种皮提取富含羟脯氨酸的细胞壁糖蛋白（HPRG )[ 15 ] 。同样，从大豆幼苗中分离出了 HPRG [16] 。细胞壁蛋白质用 10% 三氯乙酸（TCA ) 沉淀后，在余下的上清液中检测到了蛋白质。McQueen-Mason 等从黄瓜幼苗的盐溶性细胞壁蛋白质中纯化出了与延伸相关的细胞壁蛋白质 [ 17] 。McDougall [18] 用一个单一的木质部，从云杉压缩和未压缩的木材枝条细胞壁中分离出了差异表达的氧化酶。
在分化的植物组织中不常大规模开展细胞壁蛋白质组学研究，主要是由于蛋白质、多糖、多酚类污染物造成的局限性，本章描述的这种方法可用于大规模进行细胞壁蛋白质组学研究和在实验中总结的解决蛋白质污染的途径和经验（见注释）。详 见 http ://cellwall.genomics.purdue .edu。该方法涉及细胞破碎，一系列的严格的清洗，以消除污染蛋白质，并且用氯化钙和氯化锂提取细胞壁蛋白质。为确保纯度实验步骤用 Bradford 实验和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ) 凝胶检测。用一个清除试剂盒处理后 ，纯化后的蛋白质就可以准备用于双向电泳分离。用这种方法从木质化紫花苜蓿（紫花苜蓿）茎细胞壁中分离得到了大量重复的各式各样蛋白质。这种方法减少了干扰一向和二向电泳的多糖和多酚物质，使得蛋白质准备样品中污染很少含有数只百计的蛋白质数量。蛋白质点可以很容易通过基质辅助激光解吸离子化 - 飞行时间质谱（MALDITOF MS ) 或液相色谱（LC ) /MS/MS 的方法得到鉴定 [19] 。
该方法的一个缺点是明显地缺少一些往往在其他类型的细胞壁材料中能够检测到的蛋白质。这些包括高度糖基化蛋白和质膜蛋白（PM ) 。这些糖基化蛋白比其他细胞壁蛋白更易溶因此可能会在去除胞浆蛋白时的严格清洗而丢失 [ 19] 。质膜蛋白并不像其他蛋白质那样紧密结合细胞壁因此在严格的清洗条件下也同样丢失。这些蛋白质可以通过双向电泳浓缩和分离，也可以用补充的非破坏性的技术来分离它们。像其他细胞壁蛋白质的提取方法一样，此方法的要求是确保细胞壁都是无污染的。洗涤后需 要用 SDSPAGE 或免疫杂交对标志性的酶进行检测以确定蛋白质提取物的纯度。
在此方法中选择的提取用盐溶液已被普遍用来洗脱细胞壁的蛋白质。通过离子交换 ，氯化钙与结合蛋白质进行交换使细胞壁蛋白释放出来 [1] ，它的交换能力比氯化钠更有效率，与 0.1% Triton X-100 相比，氯化钙能够从活体培养的细胞壁中释放更多的蛋白质 [2] ，并且广泛应用于从植物细胞壁中提取细胞壁蛋白质 [ 1~5，7，10，12，13，16，18，19] 。众所周知膜的完整性会被 0.2 mol/L 氯化钙破坏 [ 10 ] ；因此，我们选择了用 0.2 mol/L CaCl2 从破碎的组织中提取细胞壁蛋白质。
本章介绍的方法还利用了氯化锂，一种常用的细胞壁蛋白萃取剂 [ 10，20，21] 。Voight 用不等浓度的 LiCl ( 0.1~8 mol/L ) 处理衣藻细胞并且发现从所有细胞周期阶段提取细胞壁蛋白质的最佳浓度是 2~4 mol/L，超过 4 mol/L LiCl 不会提取出更多的蛋白质。随着 LiCl 浓度的增加，更多的碳水化合物也伴随着蛋白质被提取出来。我们的方法在提取中使用 3 mol/L LiCl 来提取更多量的不含有额外共萃取碳水化合物的蛋白质。
虽然使用这种方法得到的分离洗前的细胞壁蛋白质用 SDS-PAGE 和免疫印迹检测似乎是干净的，但是只有约 50% 鉴定蛋白质有一个信号肽。与其他细胞壁蛋白的蛋白质组学研究相比，经典分泌蛋白所占比例似乎是合理的 [10，12] 并且可能反映了从一个没有膜包围的细胞器中纯化其中蛋白质固有存在的困难。它也可能暗示了蛋白质分泌的非经典途径 [ 23，24] 。
