材料与仪器
乙酸钠 NaCl 抗坏血酸 匀浆缓冲液 洗脱缓冲液
液氮 研钵和研杵 布氏漏斗 真空室或真空泵
液氮 研钵和研杵 布氏漏斗 真空室或真空泵
步骤
3.1 组织破碎、清洗、凝胶检测纯度
( 1 ) 收集 7~8 g 成熟（节间 4~6 ) 紫花苜蓿茎。这一重量的成熟茎组织这一数量中含有的细胞壁的蛋白质应多于 1 mg ( 见注释 2) 。收集后 -80°C 贮存或立即进入下一步。
( 2 ) 所有的溶液置于冰上。
( 3 ) 把茎剪成小块，1~2 cm 的长度，使研磨更容易。
( 4 ) 冻结的组织解冻（见注释 3) 。
( 5 ) 用研钵和研杵磨碎直至组织起泡沫（见注释 4 ) 。确定组织研磨好了。先在没有缓冲液条件下磨碎，然后添加 10 ml 的匀浆缓冲液再研磨一次。
( 6 ) 将研磨好的组织放在铺于布氏漏斗和真空过滤器的尼龙网过滤纸上。用刮板在滤纸上均匀铺平组织。用 15 ml 的匀浆缓冲液冲洗研钵和研杵，并用它来洗/过滤剩下的细胞碎片（见注释 5 ) 。每次用 25 ml 的缓冲液冲洗碎片颗粒 3 次以上，每 7~8 g 初始组织总共用 100 ml ( 约 14 ml 缓冲液/g) ( 见注释 6 ) 。采用真空泵去除洗液。保留洗液部分以测定纯度（见注释 7)。纯度检测的适当方法为 SDS-PAGE 分析（图 10-1A ，泳道 1 ) 或以已知胞内蛋白质的抗体进行 Western 杂交（图 10-1B ，条带 2 )。
( 7 ) 用 50 ml 洗涤缓冲液 1 ( 氯化钠洗液，见注释 8 ) 清洗碎片。把它倒在放于尼龙过滤膜上的细胞碎片并且通过真空抽滤去除。当加入洗液时关闭真空泵并确保洗液接触了所有碎片。保留洗液部分，以测定纯度（图 10-1A ，泳 道 2；图 10-1A，泳道 3) 。
( 8 ) 用 50 ml 蒸馏水重复清洗 2 次（图 10-1A，泳道 3；图 10-1B ，泳道 4 ) 。
( 9 ) 用 50 ml 冰冷丙酮冲洗 5 次（见注释 9；图 10-1A，泳道 4) 。
( 10 ) 重复步骤 9 ( 图 10-1A ，泳道 5) 。
( 11 ) 最后用 50 ml 洗涤缓冲液 2 洗一遍（10 mmol/L 乙酸钠；图 10-1A ，泳道 6；图 10-1B，条带 5 ) 。
3.2 提取细胞壁的蛋白质
( 1 ) 把细胞碎片放入中在冰上的 50 ml 管子里并且添加 7.5 ml 提取缓冲液 1 ( 氯化钙缓冲液)。倾向一边放置管子以增加细胞碎片接触提取缓冲液的表面积。固定在摇床上轻摇 30~45 min。
( 2 ) 收集蛋白质提取液（见注释 10 )，水上再次加入适量的提取缓冲液重复提取 30~45 min ( 见注释 11)。
( 3 ) 去除第二次的蛋白质提取液，将所得提取物与第一次的提取物合并。添加 15 ml 提取缓冲液 2 ( 氯化锂缓冲液）并且提取物在冰中放置至少 45 min 或在低温盒里过夜（见注释 12 和注释 13 ) 。
( 4 ) 在把提取物放入浓缩仪之前于 4°C 离心机稍稍离心（约 1000 g ) 以去除颗粒物。
3.3 蛋白质浓缩和脱盐
( 1 ) 根据仪器说明书的说明用离心浓缩仪浓缩样品（见注释 14)。我们偏向用 15 ml 的 Amicon 超速离心过滤设备。提取物可以在此步骤分开或合并。浓缩到 100~150 μl。
( 2 ) 来自 Bio-Rad 的 ReadyPrep 2-D 去除试剂盒，容纳盐的浓度髙达 1 mol/L，由于氯化锂提取物是在 3 mol/L 的氯化锂中，通过向浓缩样本中加入 2 体积蒸馏水来脱盐，将样品再次浓缩。把蛋白质溶液转入一个 microfuge 管，把 200 μl 的枪头减去枪尖可能有助于从浓缩仪中转移样品。用小体积（约 100 μl ) 的蒸馏水或缓冲液冲洗浓缩仪的膜并与浓缩的蛋白质合并起来。
3.4 蛋白质清洗，样品的水化和浓度的测定
( 1 ) 确定蛋白浓度，使用 Bradford 法或相应的方法。
( 2 ) 在这个阶段的细胞壁制备物，不进行任何进一步清洗就可用于 SDS-PAGE ( 图 10-2，泳道 1 和泳道 2) ，但蛋白条带不会像那些经过商业试剂盒处理并用 SDS 样品缓冲液溶解的那样清晰（图 10-2，泳道 3 和泳道 4）。
( 3 ) 对 2-DE ( 图 10-3A，氯化钙和氯化锂提取物相结合；图 10-3B，氯化钙提取物；图 10-3C，氯化锂提取物）来说，使用 ReadyPreP 清除试剂盒（见注释 15 ) 或其他商业化的试剂盒（见注释 16 ) 处理。然后复水缓冲液中重新悬浮。Bio-Rad 试剂盒的作用量为 100 μl 中的 1~500 μg 的蛋白质。
( 1 ) 收集 7~8 g 成熟（节间 4~6 ) 紫花苜蓿茎。这一重量的成熟茎组织这一数量中含有的细胞壁的蛋白质应多于 1 mg ( 见注释 2) 。收集后 -80°C 贮存或立即进入下一步。
( 2 ) 所有的溶液置于冰上。
( 3 ) 把茎剪成小块，1~2 cm 的长度，使研磨更容易。
( 4 ) 冻结的组织解冻（见注释 3) 。
( 5 ) 用研钵和研杵磨碎直至组织起泡沫（见注释 4 ) 。确定组织研磨好了。先在没有缓冲液条件下磨碎，然后添加 10 ml 的匀浆缓冲液再研磨一次。
( 6 ) 将研磨好的组织放在铺于布氏漏斗和真空过滤器的尼龙网过滤纸上。用刮板在滤纸上均匀铺平组织。用 15 ml 的匀浆缓冲液冲洗研钵和研杵，并用它来洗/过滤剩下的细胞碎片（见注释 5 ) 。每次用 25 ml 的缓冲液冲洗碎片颗粒 3 次以上，每 7~8 g 初始组织总共用 100 ml ( 约 14 ml 缓冲液/g) ( 见注释 6 ) 。采用真空泵去除洗液。保留洗液部分以测定纯度（见注释 7)。纯度检测的适当方法为 SDS-PAGE 分析（图 10-1A ，泳道 1 ) 或以已知胞内蛋白质的抗体进行 Western 杂交（图 10-1B ，条带 2 )。
( 7 ) 用 50 ml 洗涤缓冲液 1 ( 氯化钠洗液，见注释 8 ) 清洗碎片。把它倒在放于尼龙过滤膜上的细胞碎片并且通过真空抽滤去除。当加入洗液时关闭真空泵并确保洗液接触了所有碎片。保留洗液部分，以测定纯度（图 10-1A ，泳 道 2；图 10-1A，泳道 3) 。
( 8 ) 用 50 ml 蒸馏水重复清洗 2 次（图 10-1A，泳道 3；图 10-1B ，泳道 4 ) 。
( 9 ) 用 50 ml 冰冷丙酮冲洗 5 次（见注释 9；图 10-1A，泳道 4) 。
( 10 ) 重复步骤 9 ( 图 10-1A ，泳道 5) 。
( 11 ) 最后用 50 ml 洗涤缓冲液 2 洗一遍（10 mmol/L 乙酸钠；图 10-1A ，泳道 6；图 10-1B，条带 5 ) 。
3.2 提取细胞壁的蛋白质
( 1 ) 把细胞碎片放入中在冰上的 50 ml 管子里并且添加 7.5 ml 提取缓冲液 1 ( 氯化钙缓冲液)。倾向一边放置管子以增加细胞碎片接触提取缓冲液的表面积。固定在摇床上轻摇 30~45 min。
( 2 ) 收集蛋白质提取液（见注释 10 )，水上再次加入适量的提取缓冲液重复提取 30~45 min ( 见注释 11)。
( 3 ) 去除第二次的蛋白质提取液，将所得提取物与第一次的提取物合并。添加 15 ml 提取缓冲液 2 ( 氯化锂缓冲液）并且提取物在冰中放置至少 45 min 或在低温盒里过夜（见注释 12 和注释 13 ) 。
( 4 ) 在把提取物放入浓缩仪之前于 4°C 离心机稍稍离心（约 1000 g ) 以去除颗粒物。
3.3 蛋白质浓缩和脱盐
( 1 ) 根据仪器说明书的说明用离心浓缩仪浓缩样品（见注释 14)。我们偏向用 15 ml 的 Amicon 超速离心过滤设备。提取物可以在此步骤分开或合并。浓缩到 100~150 μl。
( 2 ) 来自 Bio-Rad 的 ReadyPrep 2-D 去除试剂盒，容纳盐的浓度髙达 1 mol/L，由于氯化锂提取物是在 3 mol/L 的氯化锂中，通过向浓缩样本中加入 2 体积蒸馏水来脱盐，将样品再次浓缩。把蛋白质溶液转入一个 microfuge 管，把 200 μl 的枪头减去枪尖可能有助于从浓缩仪中转移样品。用小体积（约 100 μl ) 的蒸馏水或缓冲液冲洗浓缩仪的膜并与浓缩的蛋白质合并起来。
3.4 蛋白质清洗，样品的水化和浓度的测定
( 1 ) 确定蛋白浓度，使用 Bradford 法或相应的方法。
( 2 ) 在这个阶段的细胞壁制备物，不进行任何进一步清洗就可用于 SDS-PAGE ( 图 10-2，泳道 1 和泳道 2) ，但蛋白条带不会像那些经过商业试剂盒处理并用 SDS 样品缓冲液溶解的那样清晰（图 10-2，泳道 3 和泳道 4）。
( 3 ) 对 2-DE ( 图 10-3A，氯化钙和氯化锂提取物相结合；图 10-3B，氯化钙提取物；图 10-3C，氯化锂提取物）来说，使用 ReadyPreP 清除试剂盒（见注释 15 ) 或其他商业化的试剂盒（见注释 16 ) 处理。然后复水缓冲液中重新悬浮。Bio-Rad 试剂盒的作用量为 100 μl 中的 1~500 μg 的蛋白质。
来源：丁香实验
