核蛋白提取
丁香园
8053
1. 前言
真核细胞的核被含有鱗脂的双层膜包裹。内层的核膜决定了细胞核自身的边界。在许多细胞中，外层核膜与糙面内质网相连。内外层核膜之间的空间与糙面内质网内腔相通。内外核膜在核孔处相连在一起。用冰冻蚀刻技术可以清楚地观察到这一现象。在分裂间期的核中，染色体呈 25 nm 粗的细长丝状，并且无法通过光学显微镜观察到。不过，在光学显微镜下可以很容易地认出细胞核中的一种亚细胞器结构。核仁形成区是一个或多个染色体上与核仁相连的区域，它包含了许多指导核糖体 RNA 合成的 DNA 的拷贝。大多数的核糖体 RNA 是在核中合成的；当核糖体 RNA 通过核孔进入细胞质时，一些核糖体蛋白被在核仁中添加到核糖体 RNA 上。
细胞中不同的细胞器在大小和密度上均有差别。大多数分离手段的起始阶段使用差速区带离心或差速离心。此技术利用了超速离心产生的很强的沉积力。最初，人们利用 2.0 mol/L 蔗糖密度梯度离心或 Percoll 密度梯度离心的方法从水稻悬浮细胞中分离细胞核 。Morre 和 Anderson 报道了一种改进的蔗糖密度梯度离心方法。该方法被证明能从水稻悬浮细胞中更加快速有效地提取核。细胞核是平均直径 20 μm 的均匀球体。豌豆细胞核同样是平均直径 20~30 μm 的均匀球体，但拟南芥的细胞核直径更小 ( 5~10 μm) 且不是球形。在植物中，已有关于水稻和拟南芥细胞核蛋白质组成分的报道。在水稻中，利用双向电泳分辨出了等电点为 4~10 的 549 个核蛋白。此结果与 Bae 等报道的拟南芥核蛋白的工作一致；他们检测到了等电点为 3~10 的 544 个蛋白质。
2. 材料
( 1 ) 用于分离核蛋白的水稻悬浮细胞培养于含有 1 ml/L 2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D ) 的 N6 培养液中。培养条件为 22°C 持续振荡。
( 2 ) 匀浆液：50 mmol/L HEPES ( pH 7.4 ) 、10 mmol/L KCl、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L 抗坏血酸、0.1% 牛血清白蛋白、20 mmol/L 二硫苏糖醇、400 mmol/L 蔗糖和 1 mmol/L PMSF。
( 3 ) 2.0 mol/L 蔗糖梯度：37. 5 mmol/L Tris-马来酸（ pH 6.5 ) 、5 mmol/L MgCl2 和 1% 糊精 （ dextran) T500 ( Amersham Biosciences，Piscataway，NJ) 。
( 4 ) 裂解缓冲液 [ 用于双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE )]：9.5 mol/L 尿素、2% NP-40、2% 两性电解质 （ Ampholine) ( pH 3.5~10.0 ) 、5% 巯基乙醇和 0.05% PVP-40 [3]。
( 5 ) SDS 样品缓冲液（用于 SDS-PAGE)：0.06 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8 ) 、2% SDS、10% 甘油和 5% 巯基乙醇 [4]。
( 6 ) 磷酸缓冲液（PBS ) ，pH 7.6：80 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaCl。
4. 注释
蛋白浓度由 Bradford 检测法测定。
参考文献
1. Morre, D. J. and Andersson, B. (1994) Isolation of all major organelles and membranous cell components from a single homogenate of green leaves. M e th o d sE n z y m o l. 228,412-419.
2. Folta, K. M. and Kaufman, L. S. (2000) Preparation of transcriptionally activenuclei from etiolated A r a b id o p s is th a lia n a . P la n t C e ll R ep . 19, 504-510.
3. OTarrell, P. H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J . B io l. C h em . 250, 4007-4021.
4. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. N a tu r e 227, 680-685.
5. Darnell, J., Lodish, H., and Baltimore, D. (1990) in M o le c u la r C e ll B io lo g y , Scientific American Books, New York.
6. Khan, M. and Komatsu, S. (2004) Rice proteomics: recent developments andanalysis of nuclear proteins. Phytochemistry 65, 1671-1681.
7. Bae, M. S., Cho, E. J., Choi, E.-Y., and Park, O. K. (2003) Analysis of theArabidopsis nuclear proteome and its response to cold stress36, 652—663.
8 . Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15, 473-497.
9. Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of micro-gram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 , 248-254.
真核细胞的核被含有鱗脂的双层膜包裹。内层的核膜决定了细胞核自身的边界。在许多细胞中，外层核膜与糙面内质网相连。内外层核膜之间的空间与糙面内质网内腔相通。内外核膜在核孔处相连在一起。用冰冻蚀刻技术可以清楚地观察到这一现象。在分裂间期的核中，染色体呈 25 nm 粗的细长丝状，并且无法通过光学显微镜观察到。不过，在光学显微镜下可以很容易地认出细胞核中的一种亚细胞器结构。核仁形成区是一个或多个染色体上与核仁相连的区域，它包含了许多指导核糖体 RNA 合成的 DNA 的拷贝。大多数的核糖体 RNA 是在核中合成的；当核糖体 RNA 通过核孔进入细胞质时，一些核糖体蛋白被在核仁中添加到核糖体 RNA 上。
细胞中不同的细胞器在大小和密度上均有差别。大多数分离手段的起始阶段使用差速区带离心或差速离心。此技术利用了超速离心产生的很强的沉积力。最初，人们利用 2.0 mol/L 蔗糖密度梯度离心或 Percoll 密度梯度离心的方法从水稻悬浮细胞中分离细胞核 。Morre 和 Anderson 报道了一种改进的蔗糖密度梯度离心方法。该方法被证明能从水稻悬浮细胞中更加快速有效地提取核。细胞核是平均直径 20 μm 的均匀球体。豌豆细胞核同样是平均直径 20~30 μm 的均匀球体，但拟南芥的细胞核直径更小 ( 5~10 μm) 且不是球形。在植物中，已有关于水稻和拟南芥细胞核蛋白质组成分的报道。在水稻中，利用双向电泳分辨出了等电点为 4~10 的 549 个核蛋白。此结果与 Bae 等报道的拟南芥核蛋白的工作一致；他们检测到了等电点为 3~10 的 544 个蛋白质。
2. 材料
( 1 ) 用于分离核蛋白的水稻悬浮细胞培养于含有 1 ml/L 2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D ) 的 N6 培养液中。培养条件为 22°C 持续振荡。
( 2 ) 匀浆液：50 mmol/L HEPES ( pH 7.4 ) 、10 mmol/L KCl、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L 抗坏血酸、0.1% 牛血清白蛋白、20 mmol/L 二硫苏糖醇、400 mmol/L 蔗糖和 1 mmol/L PMSF。
( 3 ) 2.0 mol/L 蔗糖梯度：37. 5 mmol/L Tris-马来酸（ pH 6.5 ) 、5 mmol/L MgCl2 和 1% 糊精 （ dextran) T500 ( Amersham Biosciences，Piscataway，NJ) 。
( 4 ) 裂解缓冲液 [ 用于双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE )]：9.5 mol/L 尿素、2% NP-40、2% 两性电解质 （ Ampholine) ( pH 3.5~10.0 ) 、5% 巯基乙醇和 0.05% PVP-40 [3]。
( 5 ) SDS 样品缓冲液（用于 SDS-PAGE)：0.06 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8 ) 、2% SDS、10% 甘油和 5% 巯基乙醇 [4]。
( 6 ) 磷酸缓冲液（PBS ) ，pH 7.6：80 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaCl。
4. 注释
蛋白浓度由 Bradford 检测法测定。
参考文献
1. Morre, D. J. and Andersson, B. (1994) Isolation of all major organelles and membranous cell components from a single homogenate of green leaves. M e th o d sE n z y m o l. 228,412-419.
2. Folta, K. M. and Kaufman, L. S. (2000) Preparation of transcriptionally activenuclei from etiolated A r a b id o p s is th a lia n a . P la n t C e ll R ep . 19, 504-510.
3. OTarrell, P. H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J . B io l. C h em . 250, 4007-4021.
4. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. N a tu r e 227, 680-685.
5. Darnell, J., Lodish, H., and Baltimore, D. (1990) in M o le c u la r C e ll B io lo g y , Scientific American Books, New York.
6. Khan, M. and Komatsu, S. (2004) Rice proteomics: recent developments andanalysis of nuclear proteins. Phytochemistry 65, 1671-1681.
7. Bae, M. S., Cho, E. J., Choi, E.-Y., and Park, O. K. (2003) Analysis of theArabidopsis nuclear proteome and its response to cold stress36, 652—663.
8 . Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant 15, 473-497.
9. Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of micro-gram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72 , 248-254.
