免疫亲和纯化技术

1． 将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。对于一般用途的层析柱，每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单克隆抗体或亲和纯化的多克隆抗体。将抗体和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的匀浆，在总量为10ml的溶液中加入大约lml微珠，室温孵育1h，轻轻摇动混匀。

2． 用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠（pH9.0）洗涤微珠2次，每次以3000g离心2rain或10 000g离心30s。

3． 用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠（pH9.0）重悬微珠，留取相当于10t~l湿微珠的样品。加入足量的二甲基庚二酸酯固体．至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol／L。

4． 室温孵育30min，并轻轻混匀。留取相当于10t~l偶联微珠的样品。

5． 用0.2mol／L乙醇胺pH8.0．洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0。2mol／L乙醇胺，室温孵育2h，轻轻混匀。微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS，加入硫柳汞保存。

6． 将偶联前和偶联后的微珠样品加入Laemmli样品缓冲液中煮沸后，检查偶联效果。分别取相当于1ul和9ul 2份样品在10％ SDS —聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用考马斯亮蓝染色，偶联效果良好时，在偶联前的微珠样品中显示一条55kDa的重链带，而偶联后的样品无此区带。

7． 将 抗体 包被的微珠转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器，收集残留的微珠。如果可能，仅使用结合制品中全部抗原所需的 抗体 微珠基质。

8． 用20倍柱床体积与制备抗原相同的 缓冲液 洗柱。

9． 将抗原液加到柱上，按每毫升柱体积大约lml／h的速度使抗原溶液流过层析柱，可以用一台蠕动泵控制。

10． 用20倍柱床体积的结合 缓冲液 （PBS）洗柱。

11． 用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱，建议使用预洗脱缓冲液。

12． 采用分段洗脱法，连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分。如果用过高或过低pH值的缓冲液洗脱，收集管内需加入0.1倍柱床体积的缓冲液。

13． 检测每管的抗原含量，将浓度高的各管合并。根据抗原的用途，需对获得的蛋白洗脱液透析以改变缓冲液。