【求助】基因检测，极度困难，十分无助，请帮忙

本人目前在做肺癌基因检测，靶标方面的研究，手上的标本均为05---08年肺穿刺、气管镜的组织标本，既往曾经过福尔马林固定，石蜡包埋等处理，切片后行LCM（显微切割）选出肿瘤区域。

小片组织细胞数约为50个细胞，我们的后续方法为从这样的标本组织中提取DNA（应用蛋白酶水解过夜，在蛋白酶失活方法，经过验证新近标本，均可成功），然后巢式PCR扩增，最后测序比对可能出现的突变或者缺失。

我们检测的基因为EGFR及KRAS

问题：1、这批标本PCR后跑琼脂糖凝胶电泳，根本没有条带，不知是pcr扩增失败，还是因为我们样本原因，DNA太少，不能成功。

2、标本已经没办法改变了，不管是否因为石蜡包埋年代久远还是样本量太少，不知各位战友有没有好办法，提DNA，目前我已尝试的办法有：QIAamp试剂盒，传统酚氯仿抽提，蛋白酶直接裂解煮沸法，磁珠法提DNA，均不能成功

3、目前基因检测金标准还是测序，但是鉴于我们的情况，对于AMOS或者HRM，或者是广州益善公司的液相芯片，大家觉得哪个方法可以尝试呢？

希望大家能帮帮忙，万分感谢！

请教各位专家了，谢谢了， 很棘手

还是没有什么好的建议吗？

外行不懂，提点建议。你首先得确定你的PCR检测灵敏度多少。你提取的DNA有没有进行定量？可以试试将标本直接裂解后，用裂解液梯度稀释，然后做PCR。

对于你这种情况，建议如下：
1.对于这种标本，建议用针对性的试剂盒提取，并跑电泳检测基因组DNA，不过我估计应该含量比较低，看不到；
2.PCR建议用好的酶扩，并做阳性对照，检测引物的扩增效率和监测PCR成功与否；
3.扩增的片段最好尽可能短，但是也不要太短。

PCR片段长度控制在150bp左右，再试试

应该不是DNA量少的缘故

大家一起学习，谢谢了

裂解液稀释浓度梯度尝试过了，小体系，不加水，全加模板都试过了，效果不好

pcr机器是bio-rad的，灵敏度我确实不知道

谢谢你的回复，您的意思是不是说Dundefined*段化了，都是150bp的小片段了所以扩不出来呢？

可以试一下HRM，因为HRM仪器的灵敏度比较高，即使PCR产物量很低，也能检测到！但是需要做PCR的特异性要好！

重复多次扩增