广州赛诚生物Luciferase核心实验技术：实验流程

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在调控位点分析中，Luciferase主要采用的方法为：片段缺失、定点突变 ，流程如下所示。

图1 片段缺失分析 位点流程图

图2 定点突变分析位点流程图

荧光素酶报告基因检测法是转录调控研究中十分重要的实验手段。但其结果往往存在一定的误差。未解决这一问题，现普遍采用双荧光素酶报告基因检测法。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。

实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而对照报告基因作为内对照，以使实验报告基因测试的结果归一化。作归一化可消除实验过程中减弱实验准确度的变化，如培养细胞的数量、细胞转染 及裂解的效率等。在研究转录调控启动子活性中，具体实验步骤如下。

1. 质粒转染细胞

1) 细胞 铺板：将细胞按70%的汇合度接种到96孔板。

2) 转染：16h后转染萤光素酶报告基因 质粒和RNA，每个样品设置6个复孔

a) 配制DNA和转染试剂 : 96孔板转染质粒时每孔比例为pLenti：Firefly：Renilla：转染试剂=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μL

b) 稀释好DNA及转染试剂，常温孵育5min

c) 将稀释好的DNA分别和转染试剂混匀，常温孵育20min

d) 每孔弃去15μL培养基，将15μL DNA转染混合液添加到每孔细胞样品中

e) 转染6h后，换新鲜完全培养基

2. 双报告基因检测

a) 质粒共转染48h后，弃去培养基，用100μL 1XPBS洗1遍

b) 倾斜96孔板，吸干剩余的PBS

c) 去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温

d) 每孔加50μL稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解

e) 白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL，加入100μL预先混好的LAR II，2s后测数据

f) 每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数据

注意：进行Luciferase活性检测时，需在避光条件下进行。

标签: 广州赛诚生物 哺乳动物转录调控 Luciferase 实验流程 实验技术

作者：广州赛诚生物