从果蝇胚胎中纯化核心组蛋白实验

1. 实验前准备：

1.1 材料

0～12 h 果蜗胚胎

1.2 试剂

脱色洗液：50％（V/V）家用漂白剂的蒸馏水溶液

胚胎洗液：0.7％（m/V）NaCl/0.04％（V/V）Triton X－100

缓冲液 B

缓冲液 A

1 mol/L NaOH

0.1 mol/L CaCl₂

7200 U/ml 微球菌核酸酶储液

10 mmol/L 和 500 mmol/L EDTA

10％（m/V）SDS

5 mol/L NaCl

24：1 （V/V） 氯仿/异戊醇

线形 5％～30％ 蔗糖梯度

T₅₀E₄ 缓冲液：50 mmol/L Tris·Cl（pH 7.9）/4 mmol/L EDTA

羟磷灰石树脂（如 BioGel HT 胶；Bio-Rad）

加有 0 mol/L、0.35 mol/L、2.5 mol/L NaCl 的轻磷灰石层析缓冲液

核心组蛋白储存液

1.3 耗材

BCA 分析试剂盒（Pierce）

细尼龙网（如 Sefar Amer1ca 03－08/37） 称量皿

Yamato LH－21 匀浆器（可选；Potter－Elvehjem 匀浆器）

用于 Sorvall GSA 转子（或相当的物品）的 500 ml 离心管

Mira 布 （Calb1ochemNovab1ochem） Sorval1 Superspeed 离心机，带有 GSA 和 SS-34 转子（或相当的物品）

Beckman 超速离心机，带有 SW－28 转子及适用的离心管

12 000～15 000 及 3500 MWCO 透析管

FPLC 装置

2. 细尼龙网在支撑物上放好，将约 100 g 0～12 h 果蝇胚胎放在网上。用冰冷的水彻底冲洗以去除酵母和其他污染物。

3. 将胚胎浸泡在 3L 室温的脱色洗液中 90 S。用 1L 室温的胚胎洗液快速清洗胚胎。再用蒸馏水彻底冲洗。将胚胎放在尼龙网上，透过网用纸巾吸干胚胎上的水，然后转移到称量皿中称重。

4. 将胚胎转移到一个玻璃烧杯中。每 1 g 胚胎用 3 ml 缓冲液 B 重悬。将重悬液倒入 Yamato LH－21 匀浆器中以 1000 r/min 匀浆，流出液经 Mira 布过滤收集到 GSA 管中。

5. 每 1 g 胚胎用 1 ml 缓冲液 B 冲洗原来放置胚胎的烧杯。如步骤 3，将冲洗液倒入 Yamato LH－21 匀浆器中，流出液经 Mira 布过滤收集。每 1 g 胚胎用 1 ml 缓冲液 B 再重复一次。4℃，10 000 g （GSA 转子 8000 r/min） 离心过滤液（每克胚胎 5 ml 缓冲液）20 min。

6. 弃上清。用 200 ml 缓冲液 A 重悬松散的核。4℃， 10 000 g （GSA 转子 8000 r/min） 离心 10 min。

7. 弃上清。小心不要碰到淡黄色的沉淀，用 100 ml 缓冲液 A 重悬核。4℃，10 000 g （GSA 转子 8000 r/min） 离心 10 min。

8. 弃上清。用 30 ml 缓冲液 A 重悬核。

9. 将 10 ul 重悬的核与 990 ul 1 mol/L NaOH 混匀稀释。测定溶液的 260 nm 光密度 （OD₂₆₀ ）用缓冲液 A 稀释核重悬液至 100 OD₂₆₀ 单位/ml。

10. 按如下步骤进行微球菌核酸酶消化测试：

10.1 在 1.5 ml 微量离心管中加入 1 ml 核重悬液并预热到 37℃。

10.2 加入 10 ul 0.1 mol/L CaCl₂ 和 2 ul 200 U/ml 微球菌核酸酶储液。

10.3 37℃ 温育。于 1、2、4、6、8、10、15、20 min， 分别取出 100 ul 并在其中加入 2.5 ul 500 mmol/L EDTA 终止反应。

11. 每个溶液中均加入 30 ul 水和 20 10％SDS。充分混匀后加入 40 ul 5 mol/L NaCl。混匀，用 200 ul 氯仿/异戊醇（24：1） 抽提每个溶液。

12. 从以上各溶液中取 4 ul 水相与琼脂糖凝胶加样缓冲液混合。各个样品（代表步骤 9 中的各个时间点）进行 1％ 琼脂糖凝胶电泳。用溴化乙锭染色并拍照。选取产物大多为约 2000 bp 片段的时间点。

13. 37℃ 预热核重悬液，加入 1/100 体积的 0.1 mol/L CaCl₂。加入 1/500 体积的 200 U/ml 微球菌核酸酶并转动摇匀。37℃ 温育，偶尔转动摇晃，温育的时间即为在步骤 8～11 确定的时间。加入 1/50 体积的 500 mmol/L EDTA 终止消化并置于 4℃。

14. 4℃， 12 000 g（SS－34 转子 10 000 r/min）离心 10 min。弃上清。加入 9 ml 10 mmol/L EDTA 重悬沉淀，加入 1 ml 5 mol/L NaCl 涡旋混匀 5 min。

15. 4℃， 12 000 g（SS-34 转子 10 000r/min）离心 5 min。储存上清，取 10 ul 与 990 ul 1 mol/L NaOH 混匀并测定 OD₂₆₀。

16. 在 SW28 管的蔗糖梯度缓冲液中制备 5％～30％ 蔗糖线性梯度（各 18～20 ml），其上加入≤500 OD260单位的上清液。4℃，90 000 g （SW28 转子 26 000 r/min） 超速离心 16 h。

17. 将梯度以每管 2 ml 回收，每个回收产物取 8 进行 15％ SDS-PAGE 电泳。考马斯亮蓝染色并脱色。将含有核心组蛋白峰的回收片段集中，在 12 000～15 000 MWCO 透析管中于 4℃ 对 2L T50E4 缓冲液进行透析 2 次，每次 2h。

最好将每个梯度的回收片段都收集到 50 ml 锥形管中。如果在含蔗糖的回收片段中有悬浮的碎片，透析后离心去除。回收的经消化的染色质可以在 4℃ 保存几个月，并且核心组蛋白的完整性不会丧失。如果选定的组分要进一步纯化，小心避免含有组蛋白 H1 的组分的混入。

18. 取 10 ul 经透析的样品与 990 ul 1 mol/L NaOH 混匀并测定 OD₂₆₀。 每 1.5 mg DNA 需 1 ml 柱体积，计算需要多少体积的羟磷灰石树脂。

19. 选择适当大小的羟磷灰石柱，装在 FPLC 上，用 3 倍柱体积的无 NaCl 的 HA 层析缓冲液平衡柱。

20. 将透析的样品上到柱上，用 3 倍柱体积的无 NaCl 的 HA 层析缓冲液清洗。用 3 倍柱体积的含 0.35 mol/L NaCl 的 HA 层析缓冲液清洗以洗脱除组蛋白外的其他 DNA 结合蛋白。

21. 用 2 倍柱体积的含 2. 5 mol/L NaCl 的 HA 层析缓冲液洗脱核心组蛋白。

22. 取 2 ul 蛋白峰组分进行 15％SDS-PAGE 电泳分析。考马斯亮蓝染色并脱色。将含有核心组蛋白峰的回收组分集中，在 3500 MWCO 透析管中于 4℃ 对 2L 核心组蛋白储存缓冲液进行透析 2 次，每次 2 h。

23. 透析后，使用 BCA 分析系统确定组蛋白的浓度。分装于微量离心管中，并在液氮中速冻。－80℃ 可以保存几年。