羟磷灰石层析法纯化核心组蛋白实验
最新修订时间：
材料与仪器
精核
HAP 缓冲液 BioGel HTP 粉（Bio－Rad）Bio－Rad 蛋白定量系统（可选）
2 cm×15 cm 柱及附件 Centriprep－10 浓缩器（Amicon； 可选）
HAP 缓冲液 BioGel HTP 粉（Bio－Rad）Bio－Rad 蛋白定量系统（可选）
2 cm×15 cm 柱及附件 Centriprep－10 浓缩器（Amicon； 可选）
步骤
1. 用 25 ml HAP 重悬约 2 ml 精核（约含有 6 mg DNA），4℃ 轻轻搅动 10 min。
2. 边搅动，边加入 10 g BioGel HTP 干粉。
3. 加入足够的 HAP 缓冲液使成浆状，并加入到 2 cm×15 cm 柱中，收集洗脱液。
4. 用 10 体积的 HAP 缓冲液洗涤树脂（约 300 ml 以 30 ml/h 的速度）。
5. 用含有 2.5 mol/L NaCl 的 HAP 缓冲液洗脱核心组蛋白，每 8 ml 收集一管。
6. 测量 A230 或 A280 值或者使用蛋白质定量系统，确定蛋白质的浓度，将同一蛋白质峰的成分合并。
组蛋白 A230 的消光系数（虽然计算源自鸡的红细胞组蛋白，但是与哺乳动物组蛋白的相近）为 4.3 U/mg 组蛋白/ml。另外，Bio-Rad 或其他蛋白质定量系统可以通过以 BSA 为标准测得。使用 BiaRad 蛋白质定量系统测得的浓度比使用 A230 的方法高 1.6 倍。
7. 通过测定传导读数确定已合并的每个库成分的盐浓度。盐浓度应为 2 mol/L 左右。
8. 如通过 SDS-PAGE 确定核心组蛋白的纯度。
9. 如有需要，使用 Centriprep－10 浓缩器浓缩核心组蛋白至浓度为 2～10 mg/ml。
10. 分装液体，在干冰上速冻，可在 -80℃ 保存 4 年左右。
来源：丁香实验
